段金菊课题组研究铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药机制的阶段性成果

铜绿假单胞菌是临床上重要的条件致病菌，其致病性强，致死率高。氟喹诺酮类药物是临床上治疗铜绿假单胞菌感染的一类重要的药物，其中环丙沙星和左氧氟沙星最常用。然而，铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药性已经出现。中国抗菌药物监测网的数据显示2017年铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药率达14.8%。此外，一项来自美国国家医疗健康网的报告表明铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药率达到30%。铜绿假单胞菌的耐药性正逐渐成为世界范围内的公共威胁。氟喹诺酮类药物通过抑制细菌的DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ来抑制DNA复制进而起到杀菌作用。理论上讲，铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物的特定分子耐药机制主要包括编码DNA促旋酶的基因gyrA和gyrB的突变以及编码拓扑异构酶Ⅳ的基因parC和parE的突变。但目前的许多研究均表明gyrA和parC基因突变在铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药性中发挥关键作用，较少有研究阐明gyrB突变与耐药性的关系。此外，临床上在治疗铜绿假单胞菌引起的感染过程中，患者最初对氟喹诺酮类药物敏感，但在使用一段时间后敏感性降低从而导致治疗失败。

2019年1月，段金菊课题组在SCI学术期刊Infection and Drug Resistance（医学2区，影响因子3.443）发表了题目为“Mutations ingyrBplay an important role in ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa”的研究论文。该研究从上述问题出发，在体外用不同浓度的环丙沙星诱导铜绿假单胞菌5天，测定诱导后菌株的MIC值并分析其耐药性。此外，测定外排泵基因的表达量和gyrA、gyrB、parC和parE四个基因的突变情况以探究该研究中铜绿假单胞菌的耐药机制，并据此分析诱导浓度和诱导时间对耐药性及耐药基因突变的影响。

该研究的主要结果有：

1.体外环丙沙星和左氧氟沙星诱导后菌株的耐药性

环丙沙星和左氧氟沙星诱导以后菌株的MIC值随时间的变化趋势不一致（P<0.05），且与左氧氟沙星诱导相比，环丙沙星诱导后菌株的MIC值表现出更高和更快的增长（见图1）。同时，环丙沙星诱导后菌株的耐药率逐渐比左氧氟沙星诱导后菌株的耐药率高，在诱导第5天，环丙沙星诱导的菌株耐药率明显高于左氧氟沙星（P<0.05）。因此认为体外环丙沙星的诱导能力强于左氧氟沙星。之后均选用环丙沙星诱导的菌株进行实验。

Figure 1 The comparison of MICs of strains to CIP and LEV between two groups.

A: ciprofloxacin (CIP) B: levofloxacin ( LEV)

*: There is statistical difference between CIP group and LEV group for the same MIC increment and the same drug (P<0.05).

**: There is statistical difference between CIP group and LEV group for the same MIC increment and the same drug (P<0.001).

2.外排泵基因的表达量

该研究中的细菌诱导以后外排泵未高表达，也就是说诱导以后细菌产生耐药的机制不是由于外排泵高表达。不同浓度（0.5×MIC，1×MIC，2×MIC和4×MIC）的环丙沙星诱导5天后，菌株外排泵的表达量结果见图2。

Figure 2 The relative expression of two efflux pumps genes-MexA and MexE.

A: MexA B:MexE

The efflux pump was highly expressed if the relative expression of MexA was higher than 3.00.

The efflux pump was highly expressed if the relative expression of MexE was higher than 10.00.

3.喹诺酮类耐药决定区基因的突变

在诱导以后的氟喹诺酮类药物耐药的菌株中，主要检测到了gyrA和gyrB的突变，未检测到parC和parE的有义突变。进一步分析发现（见表1），gyrB在诱导第一天即发生突变，而gyrA在诱导第三天发生突变，也就是说gyrB比gyrA突变发生得早。而且，所有菌株都发生了gyrB突变，而仅5株菌发生了gyrA突变。同时，gyrB氨基酸突变的数目比gyrA的多。值得注意的是，有5株菌同时发生了gyrA和gyrB突变，但是其MIC值并不比仅发生gyrB突变的菌株MIC值高。因此，我们认为gyrB突变在铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药性中发挥重要作用。另一方面，我们发现随着时间的延长和浓度的增加，两个基因发生氨基酸突变的数目均增加，结合菌株的MIC数据发现，随着时间的延长和浓度的增加MIC值也呈现增加的趋势。这在一定程度上可以认为抗菌药物的使用浓度和时间影响菌株的耐药水平和耐药基因的突变情况，但两者之间具体的关系需要进一步验证。

Table 1 Amino acid alterations of P.aeruginosa ingyrA

-: No amino acid alteration Blank: No sequencing

山西医科大学药学院冯新媛硕士研究生为该论文第一作者，山西医科大学第二医院药学部段金菊主任药师为该论文的通信作者。该项目得到了山西省自然科学基金的支持。