4-丁基多羟基二苯甲酮衍生物YX2通过SIRT1/PGC1α促进NAFLD线粒体生物发生

第一部分：双荧光素酶报告基因系统初筛发现36个4-丁基多羟基二苯甲酮衍生物中有6个衍生物具有PGC1α转录激活活性，分别为：DL2、DX2、S4、YD、YM、YX2。以细胞存活率、脂质蓄积和肝酶水平为指标复筛发现，6个衍生物中YX2对HepG2细胞（PA诱导损伤）的保护活性最好，EC₅₀值为1.02 × 10^-2± 1.56 × 10^-3μmol/L，且YX2显著改善细胞脂质蓄积和肝功能异常。因此，我们选择了YX2作为候选衍生物进行后续研究。

图1 36个4-丁基多羟基二苯甲酮衍生物对PGC1α启动子的影响

（与Control组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001）。Ctrl:培养液

Figure 1 Effects of thirty-six 4-butyl-polyhydroxy-benzophenone derivatives on PGC1α promoter activity. Compared with that in the control group,^###P < 0.001; compared with that in the model group,^*P< 0.05 and^***P< 0.001. Ctrl, control

第二部分：与模型组相比，YX2组（1、5、25 μmol/L）细胞的TG、TC、ALT、AST、LDH活性显著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可改善HepG2细胞（PA诱导）脂质蓄积和肝酶增高。将模型组和YX2组（25 μmol/L）细胞的差异蛋白进行富集分析，发现YX2引起NAFLD通路和氧化磷酸化通路显著变化（P <0.05），亚细胞定位发现差异蛋白主要分布在线粒体，蛋白质组学结果提示，YX2的治疗作用可能与线粒体修复和生物发生高度相关。三个剂量的YX2组细胞GSH水平显著增高，Mito SOX Red荧光强度显著下降（P <0.01或P <0.001），且呈剂量依赖性，表明YX2可减轻细胞氧化应激。YX2组（25 μmol/L）细胞线粒体形态损伤显著缓解且ATP水平、氧耗率、JC-1红色/绿色荧光比值、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），DRP1的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2可修复线粒体功能损伤。YX2组（25 μmol/L）细胞Mito-Tracker荧光强度、mtDNA拷贝数、ND6的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可缓解线粒体生物发生障碍。

图2模型组和YX2组（25 μmol/L）差异蛋白质的富集分析结果：

A. KEGG功能富集；B. GO Cellular Component富集

Figure 2 Enrichment analysis of differentially expressed proteins between the model and25 μmol/LYX2-treated HepG2 cells. A. KEGG functional enrichment. B. GO Cellular Component enrichment.

图3 YX2缓解脂质损伤的HepG2细胞线粒体生物发生障碍：A. mtDNA拷贝数；B. ND6的mRNA表达；C. ND6的蛋白表达（与Control组相比，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001）

Figure 3 Compound YX2 ameliorated dysregulated mitochondrial biogenesis in lipid-damaged HepG2 cells. A. mtDNA copy number. B. ND6 mRNA level. C. ND6 protein level. Compared with that in the control group,^##P<0.01 and^###P<0.001; compared with that in themodel group,^*P<0.05,^**P<0.01 and^***P<0.001

第三部分：与模型组相比，YX2组（25 μmol/L）细胞的SIRT1、PGC1α、NRF1、TFAM的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可上调HepG2细胞（PA诱导）SIRT1/PGC1α信号通路。与YX2组（25 μmol/L）相比，SIRT1敲降组细胞存活率显著下降（P< 0.01），TG、TC、ALT、AST、LDH水平显著升高（P< 0.001），SIRT1过表达组细胞存活率显著升高（P< 0.05），TG、TC、ALT、AST、LDH水平显著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2通过SIRT1改善HepG2细胞存活率、脂质蓄积和肝酶增高。SIRT1敲降组细胞GSH水平显著下降（P< 0.001），SIRT1过表达组GSH水平显著升高（P< 0.001），表明YX2通过SIRT1阻止HepG2细胞内谷胱甘肽降低。SIRT1敲降组细胞氧耗率、ATP水平、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），DRP1的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.01或P< 0.001），SIRT1过表达组细胞ATP水平、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2修复线粒体功能障碍依赖于SIRT1。SIRT1敲降组细胞ND6的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P< 0.05或P< 0.001），SIRT1过表达组细胞ND6的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2靶向通过SIRT1缓解线粒体生物发生障碍。SIRT1敲降组细胞SIRT1、PGC1α、NRF1、TFAM的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），SIRT1过表达组细胞SIRT1、PGC1α、TFAM的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2靶向通过SIRT1上调SIRT1/PGC1α信号通路。SYBYL软件模拟YX2与SIRT1结合Total Score为7.72，形成3个氢键，表明二者结合作用强；YX2可以提高HepG2细胞内源性SIRT1蛋白的热稳定性，表明二者直接结合；YX2与SIRT1的解离平衡常数K_D达712 μmol/L，表明二者有特异性结合；YX2与SIRT1之间以1:1的摩尔比结合，结合常数K_A为25322 L/mol，二者作用属于静态猝灭，氢键和范德华力主导了二者的直接结合，且结合位点更接近色氨酸残基，结果共同表明YX2促进NAFLD线粒体生物发生作用的靶点是SIRT1。进一步染色质免疫沉淀实验表明SIRT1可与PGC1α启动子结合，且YX2可显著上调此种结合（P< 0.001）。

图4 YX2上调HepG2损伤细胞的SIRT1/PGC1α信号通路关键基因的mRNA表达：

A. SIRT1；B. PGC1α；C. NRF1；D. TFAM（与Control组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001）

Figure 4 Compound YX2 upregulated the SIRT1/PGC1α pathway in lipid-damaged HepG2 cells. A. SIRT1 mRNA level. B. PGC1α mRNA level. C. NRF1 mRNA level. D. TFAM mRNA level. Compared with that in the control group,^###P<0.001; compared with that in themodel group,^*P<0.05,^**P<0.01 and^***P<0.001

图5 YX2促进SIRT1与PGC1α启动子的结合

（与Control组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^**P<0.01）

Figure 5 Compound YX2incresed interaction ofSIRT1withPGC1α promoter. Compared with that in the control group,^###P <0.001; compared with that in themodel group,^***P<0.001

第四部分：与模型组相比，YX2组（25 mg/kg）小鼠体重和肝脏系数显著下降（P< 0.05或P< 0.001），肝脏病理损伤明显缓解，血清TG、TC、LDL、ALT、AST水平显著下降，HDL水平显著升高，肝脏TG、TC、ALT、AST、LDH水平显著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可改善NAFLD小鼠的血脂紊乱和肝脏脂质蓄积。YX2组（25 mg/kg）小鼠肝脏上调倍数最大和最小的差异代谢物均与能量代谢相关，差异代谢物富集分析发现YX2引起氧化磷酸化通路变化显著（P< 0.05），与细胞蛋白组学的实验结果一致，提示YX2的作用与线粒体高度相关；YX2组（25 mg/kg）小鼠肝脏下调最显著的差异脂质为TG (14:0/19:0/20:4)，毒性脂质二酰基甘油、游离胆固醇、饱和脂肪酸、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱显著下调（P< 0.05）；脂质组学实验结果进一步提示，YX2可减轻NAFLD小鼠肝脏脂毒性。YX2组（12.6、25 mg/kg）小鼠血清GSH水平显著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2可改善NAFLD小鼠机体的抗氧化系统。YX2组（25 mg/kg）小鼠肝脏ATP水平、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05或P< 0.001），DRP1的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2可修复线粒体功能障碍。YX2组（25 mg/kg）小鼠肝脏mtDNA拷贝数、ND6的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P< 0.05），表明YX2可缓解线粒体生物发生障碍。YX2组（25 mg/kg）小鼠肝脏SIRT1、PGC1α、TFAM蛋白表达水平显著升高（P< 0.05或P< 0.01），表明YX2可上调肝脏SIRT1/PGC1α信号通路。与YX2组（25 mg/kg）相比，抑制剂组小鼠（EX527，5 mg/kg）肝脏系数、血清TG、AST水平显著升高（P< 0.05或P< 0.01），HDL水平显著下降（P< 0.05），肝脏AST、LDH活性显著升高（P< 0.05或P< 0.01），表明YX2缓解NAFLD小鼠作用呈SIRT1依赖性。抑制剂组小鼠肝脏mtDNA拷贝数显著下降（P< 0.05），表明YX2可能通过SIRT1缓解线粒体生物发生障碍。

图6 模型组和YX2组（25 mg/kg）小鼠肝脏代谢组学结果A.代谢物火山图；

B.注释到大于10个差异代谢物的HMDB分类图；C. KEGG功能富集结果

Figure 6 The analysis of differentially expressed metabolites between the25 mg/kg

YX2-treated and the model group. A. Volcano plot of all identified metabolites. B. The top six HMDB classification. C. KEGG functional enrichment.

研究结果表明：4-丁基多羟基二苯甲酮衍生物YX2可靶向结合SIRT1，激活PGC1α转录，明显缓解肝脏组织（肝细胞）的脂质蓄积、肝酶异常，减轻氧化应激，修复线粒体功能和生物发生障碍，激活SIRT1/PGC1α信号通路，为临床防治NAFLD提供新的思路，具有重要的理论价值和临床意义。