杨晓峰、魏亮研究组和合作者构建并验证了膀胱癌体细胞突变驱动的代谢相关基因预后模型

膀胱癌(BLCA)是泌尿系统中侵袭性最高的恶性肿瘤之一，具有高复发率和高死亡率的特点，尽管方法多样且均取得巨大进步，但仍有超过半数的患者治疗后会出现复发或进展，如何按照预后准确进行患者分群，并提早调整治疗策略，是临床函待解决的难题。改变现状的方法之一应是研究和纳入更多新的有价值的预后因子，来优化我们的预后预测评价体系，尤其是筛选出高危病人并提早调整治疗方案，同时也有望找到新的治疗靶点。因此，研究新型分子生物标记物在膀胱癌的筛查、诊治、预后中有着巨大的潜力和价值。

近些年研究表明癌细胞普遍存在代谢改变，以维持其在不利环境下的增殖和演进，主要表现为：葡萄糖代谢以有氧糖酵解为主，氧化磷酸化减弱，磷酸戊糖代谢途径增强，谷氨酰胺分解代谢活跃，脂肪酸从头合成及β-氧化反应活跃等，这些代谢改变被称为代谢重编程( Metabolic reprogramming )。限制或改变上述代谢重编程过程可以抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞死亡，调节代谢重编程可作为肿瘤靶向治疗的新策略。而基因改变往往会通过重编程代谢导致癌症进展，它是表观遗传、氧化还原状态、外泌体、肿瘤相关成纤维细胞（CAF）和免疫细胞改变的重要原因，这也使得癌症代谢及其相关基因成为研究的热点。

2023年5月杨晓峰、魏亮研究组和合作者撰写的论文Construction and validation of a prognostic model of metabolism-related genes driven by somatic mutation in bladder cancer被Frontiers in Bioscience-Landmark杂志录用。本研究通过综合生物信息学分析，初步建立并验证了一个新的预后预测模型，揭示了体细胞突变驱动的代谢相关基因在膀胱癌中的表达、预后价值和功能，并预测了膀胱癌免疫治疗、化疗疗效的潜在标记物。另外，通过单细胞数据分析我们发掘了生物标志物随上皮细胞状态的变化发生表达量的改变，并据此鉴定出影响膀胱癌预后和需要我们深入研究的两个关键上皮细胞亚群。

1.差异表达的代谢相关基因的筛选和功能富集分析

本研究基于TCGA数据库筛选到201个差异表达代谢相关基因（DEMRGs），其中93个代谢相关基因表达上调，108个代谢相关基因表达下调。功能富集分析得到477个GO BP，47个GO CC，178个GO MF，包括酒精代谢过程、细胞修饰氨基酸代谢过程、跨膜转运体复合物、转运体复合物、金属离子跨膜转运体活性、离子通道活性等。富集到226条KEGG通路，包括cGMP-PKG信号通路、嘌呤代谢、胰腺分泌、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢等。（图1）

图1 DEMRGs的筛选和功能富集分析

2.风险模型的构建

根据TCGA体细胞突变数据，筛选出24个突变频率>为3%的DEMRGs。采用单因素和多因素COX分析，鉴定出5个膀胱的预后生物标志物（FASN、ATP8B2、ABCC4、ATP2B4、MTHFD1L）。然后我们绘制5个预后相关基因的ROC曲线，检验模型基因的预后预测能力，结果显示单个基因的AUC均大于0.7，但利用这5个基因构建的预测模型，ROC曲线的AUC为0.97，证实了模型的有效性和准确性更高，优于单个基因的预测能力。（图2）

图2 膀胱癌中的模型基因的分析

3.预后风险模型的验证

绘制了两组模型基因表达的风险曲线和热图。ABCC4在低危组的表达量较高，且HR <为1，提示它可能是预测患者预后的一个重要因素。而FASN、ATP8B2、ATP2B4、MTHFD1L为HR > 1，在高危组中高表达。Kaplan-Meier曲线显示，高危组患者的生存率低于低危组。ROC曲线显示1-5年的auc均为>0.6。随后，在测试集和验证集中评估风险模型的预后。在测试集、验证集和训练集中，基因表达模式是一致的。另外，计算不同组的突变频率，所有突变样本中生物标志物的突变频率均大于8%，高危组的突变类型增加。

图3 预后基因风险评分系统的验证

4.风险模型的独立性预测

相关性结果显示，预后风险评分和临床特征之间存在显著性差异。T期K-M生存曲线结果显示，两组在病理T2、T3、T4期生存差异有统计学意义。除性别外，所有临床因素的p值均小于0.05。采用多变量Cox分析，将riskScore、t病理、年龄和n病理作为独立的预后指标。同时，列线图和校准曲线所示，列线图C指数为0.7287，说明该模型具有较好的预测能力。（图4）

图4 膀胱癌患者5个预后基因的临床价值评估

5.免疫微环境、免疫检查点及抗癌药物敏感性分析

我们分析了这些相关性，以证明免疫微环境中细胞浸润的相互作用。对22个免疫细胞群的分析发现，4个免疫细胞的比例有显著差异。这4种免疫细胞分别是B细胞记忆细胞、巨噬细胞M0、静止的树突状细胞和T细胞。K-M生存曲线分析显示，两组LGALS9、PDCD1和TIGHT的免疫检查点有显著差异。并对其表达水平进行分析，结果显示两组间三个免疫检查点的表达水平存在显著差异，低危组LGALS9显著升高，PDCD1缺失，TIGHT明显降低。相关分析结果显示，风险评分与PDCD1、TIGIF呈显著正相关，风险评分与LGALS9呈负相关。（图5）

另外，在198种抗癌药物反应中，有146种药物在两个风险组之间存在显著差异。高危组患者对42种药物更为敏感，包括5-Fluorouracil_1073、Camptothecin_1003、Docetaxel_1819等。而低危组患者对104种药物更为敏感，包括Cisplatin_1005、Epirubicin_1511、Gemcitabine_1190、Vinblastine_1004等。

图5免疫微环境和免疫检查点的分析

6.膀胱癌中生物标志物的单细胞分析

通过scRNA-seq数据分析，对核心细胞进行筛选，鉴定出2000个表达水平差异较大的基因，以便进行后续分析。PCA结果显示，样本细胞的总体分布相似，没有离群值样本，共筛选了15个主成分（p<0.05）用于后续分析。另外，所有核心细胞的P值均小于0.05，因此我们使用所有核心细胞进行分析。聚类结果表明，核心细胞被分离成10个主要的不同的聚类。并对差异标记基因进行鉴定，并绘制每个聚类中前10个标记基因的表达热图。这些集群包括两种带有上皮细胞和DC细胞的细胞。由于采集的样本为上皮细胞，DC细胞所占比例相对较小，因此取出DC细胞进行后续分析。将核心细胞投射到一个根和两个分支上，构建单个细胞轨迹图。所有生物瘤的表达情况均发生了变化。将单细胞GSE135337数据集中的GSM4006644样本的核心细胞根据其基因表达谱分为两个聚类。这些聚类被命名为低表达组（聚类1）和高表达组（聚类2）。然后，统计两组之间的细胞类型。聚类2和聚类3在两组中差异最大。此外，簇2和簇3的细胞分别受到其他簇细胞的影响。（图6）

图6 单细胞RNA测序分析

7.验证基因表达水平

本研究采用qRT-PCR进一步验证了10例患者的生物标志物（ABCC4、FASN、FASN、ATP2B4、ATP8B2、MTHFD1L）在正常对照组和癌组织中的表达水平。qRT-PCR分析结果显示，这些基因的表达水平存在显著性差异。癌组织中FASN和MTHFD1L的mRNA水平显著升高，而ABCC4、ATP2B4和ATP8B2的mRNA水平显著降低。（图7）

图7 qRT-PCR分析ABCC4、FASN、ATP2B4、ATP8B2和MTHFD1L的mRNA水平

综上所述，本研究构建了一种基于与代谢重编程相关的临床和分子因素的新预后模型，有可能改善膀胱癌患者独立预后的预测和管理，从而获得更好的治疗结果和生存率。本研究的主要优势在于利用传统转录组数据和单细胞数据联合分析鉴定体细胞突变驱动的代谢相关基因在膀胱癌中的生物学意义。

本项研究第一作者是山西医科大学博士魏亮，而山西医科大学第一医院杨晓峰作为该论文的通讯作者。本研究工作获得山西省基础研究计划项目面上项目“卡介苗无反应非肌层浸润性膀胱癌单细胞免疫组库信息学特征的研究（编号：20210302124412）”的经费支持。