激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope 简称LSCM）是以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。

激光共聚焦显微镜（LSCM）属于细胞生物领域的新型仪器，在医学基础研究中应用于多重荧光影像、3D 立体影像重建、3D 动态影像获取与分析、神经立体分布影像、形态与动态分析、次微米单晶荧光影像技术、多重荧光蛋白影像技术 、荧光共振能量转移、细胞离子流定量分析、长时间影像记录、Z轴扫描与测量、基因影像分析、染色体多重荧光原色表现、活体胚胎研究、穿透光影像/反射光影像、材料表面分析、材料显微硬度分析、晶园分析及薄膜分析。简而言之，只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用激光共聚焦显微镜观察。

激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛：

1、细胞生物学： 如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞细胞骨架与核改变之间的关系；细胞黏附行为等

2、生物化学： 如：酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确。

3、药理学： 如：药物对细胞的作用及其动力学；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量

4、生理学、发育生物学： 如：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；动物发育以及胚胎的形成，骨髓干细胞的分化行为；细胞膜电位的测量.荧光漂白恢复（FRAP）、荧光漂白丢失（FLIP）的测量等。

5、遗传学和组胚学： 如：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断；

6、神经生物学： 如：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递；

7、微生物学和寄生虫学： 如：细菌、寄生虫形态结构；

8、病理学及病理学临床应用： 如：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断；

9、免疫学、环境医学和营养学。 如：免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达，荧光能量共转移（FRET）。

近年来，我实验中心激光共聚焦显微镜做了大量科研工作，其中有多种细胞形态学研究、细胞骨架观察、细胞凋亡检测、细胞线粒体及胞浆钙离子动态检测、细胞的三维结构扫描、免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位等工作。

本实验中心的流式细胞仪是日本奥林巴斯公司产，型号：FV1000，配有405nm、458nm、488nm、515nm、559nm和635nm激光器，可以同时做四通道检测。

标本来源及要求：

样品来源：各种组织或者细胞

1.切片 实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石 蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。常用的贴附剂有：多聚赖氨酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶cell-Tak, vectabond等。

2培养细胞 培养细胞均可以满足要求，如果用薄底培养瓶/皿进行培养则更佳，如需获得高倍数图像（600倍/1000倍）则需进行爬片。

激光共聚焦显微镜在科研应用的实例

1.药物干扰后大鼠干细胞形态变化

2.检测胞浆内Ca2+动态变化

培养的细胞经20μM Fluo 4-AM负载液染30min 后，清洗、换液，上机扫描，每20sec扫描一次，5min后加入KCl，继续扫描测试。

实验原理：Fluo 4-AM是的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo 4随后会和钙离子结合并发出荧光，细胞中钙离子含量越高绿荧光越强，通过检测绿色荧光强度值随时间的变化，得到Ca2+浓度随时间变化的曲线。

实验原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

4.3D扫描

谷类花粉粒Z轴扫描，每45μm取一张片子。

5.荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递

实验原理：选择对应的荧光染料标记A、B、C区域的某一小分子，于高强度脉冲激光来照射细胞A、B区域，造成该区域荧光分子的光粹灭（即光漂白），一段时间后，该区域周围（C区域）的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,因而可检测该小分子是否有扩散现象。

6.共定位 是指两个或多个分子完全处于同一空间位置上。这些分子一般是指蛋白，可以用荧光抗体或探针加以检测。

开机时间： 周一 —— 周五（电话预约））

流式细胞室： 转化医学研究中心三层A310室4135485转9016