今天跟大家分享的文献是2022 年 2 月发表在 Cancer Immunology, Immunotherapy（2021 年 IF=6.968）杂志上的一篇文章。文中涉及三个研究队列， 中山医院基层浸润膀胱癌患者队列、TCGA 膀胱癌队列和 IMvigor210 trial 中接受 PDL1 治疗的膀胱癌患者队列进行研究，鉴定到潜在相关肽 (Latency-associated peptide, LAP)也成为隐形肽的表达水平与膀胱癌患者的预后有关，可以作为一种潜在的治疗靶点。

图 1 Cancer Immunology, Immunotherapy

背景介绍：

转化生长因子 -β（transforming growth factor-β, TGF-β)是属于一组调节细胞生长和分化的 TGF-β超家族。这一家族除 TGF-β外，还有活化素（activins)、抑制素（inhibins)、缪勒氏管抑制质（Mullerian inhibitor substance, MIS) 和骨形成蛋白（bone morpho-genetic proteins, BMPs）。

TGF-β的活化过程是其发挥正常功能的关键步骤，是一个受多种因素影响的复杂过程。TGF-β的活化在细胞外完成，是受多种因素影响的复杂过程。在胞内，TGF-β的各种异构体都是由各个独立基因产生的，先是被合成前体蛋白，然后在内肽酶、Furin 酶作用下产生 TGF-β蛋白 N 端的二聚体潜在相关肽（Latency-associated peptide, LAP）和 C 端的二聚体成熟型 TGF-β，这两部分以非共价形式相连，即 TGF-β与 LAP 的复合物，它不具有生物活性 [1]。LAP 上的半胱氨酸富集区能够结合 TGF-β功能区，并且 LAP 上具有结合潜在 TGF-β 结合蛋白和整合素的识别区域 [2]，TGF-β与 LAP 的复合物被分泌到细胞外后，经过复杂的过程，并在 TGF-β 结合蛋白、整合素、BMP、活性氧等的作用下，LAP 被祛除或发生构型改变，导致复合物瓦解，方可释放具有生物活性的 TGF-β，TGF-β通过与细胞膜表面特异性受体结合才能发挥生物学效应 [3]。

流程图

结果

1. 瘤内 LAP 表达预示 MIBC 患者预后不良

作者首先研究了中山医院膀胱癌队列癌组织中 LAP 表达的临床意义。高 LAP + 细胞浸润患者的预后明显较差 (OS: P = 0.001, RFS: P ＜0.001; 图 1a)， TCGA 膀胱癌队列的结果一致(图 1b)。此外，多因素 cox 分析显示，癌组织 LAP 阳性和 TGFB1 阳性是膀胱癌患者 OS 的独立预后指标(图 1c、d) 和 RFS (图 1c、d)在两个队列中。因此，癌组织 LAP 阳性预示膀胱癌患者预后不良。

图 1 Intratumoral LAP expression predicts dismal prognosis in MIBC patients.

2. 癌组织 LAP 阳性表明 MIBC 患者对铂类辅助化疗的反应减弱

进一步研究癌组织 LAP 阳性和铂类辅助化疗反应之间的相互关系。我们发现，铂类辅助化疗对低表达 LAP 的膀胱癌患者具有显著的生存益处 (图 2b)，而对所有患者(图 2a) 和高表达 LAP 的患者(图 2c)， 铂类辅助化疗没有显示生存益处。

同时，单因素分析也证实铂类辅助化疗仅能低表达 LAP 膀胱癌患者的 OS (图 2d) 和 RFS (图 2d)。亚组分析显示，低表达 LAP 的膀胱癌患者预后较好 (图 2 d)。因此，这些结果表明，低表达 LAP 的膀胱癌患者更有可能受益于铂类辅助化疗。

图 2 Intratumoral LAP expression indicates attenuated responsiveness to adjuvant chemotherapy in MIBC patients.

3. 瘤内 LAP 表达与 MIBC 中 CD8 + T 细胞的免疫逃逸环境和功能障碍相关

为了探讨基于 LAP 表达可以对膀胱癌患者的预后进行分层潜在机制，作者接下来进行了 CIBERSORT 计算 TCGA 膀胱癌队列中低表达 TGFβ的病人和高表达 TGFβ的病人癌组织免疫细胞浸润水平。结果显示，高表达 TGFβ患者促肿瘤细胞，包括 M2 巨噬细胞和中性粒细胞 (图 3a)。但是，抗肿瘤的 CD8+T 细胞浸润水平也较高。为了验证 TCGA 队列的结果，作者对中山医院收治的膀胱癌患者的组织样本进行免疫组化染色，以检测各种肿瘤浸润免疫细胞的水平。和 TCGA 结果一致，在 TGFβ高表达亚组中发现了以 M2 巨噬细胞、中性粒细胞和 CD8 + T 细胞浸润升高为特征的免疫抑制 TME(图 3b)。

图 3 Intratumoral LAP expression associated with an immunoevasive contexture with dysfunctional CD8 + T cells in MIBC.

由于 CD8 + 细胞浸润增加与高表达 LAP/TGFβ的患者生存差相矛盾，我作者接下来探讨了 LAP/TGFβ高表达亚群中 CD8 + T 细胞的功能状态。经典的免疫检查点, 如 CTLA-4 PD-1 PDL1, 在 TGFβ 高表达组的表达水平高于低表达组 (图 3 c 和 d)。GSEA 富集分析提示耗竭表型的 CD8 + T 细胞基因集在 TGFβ上调 (图 3 e)。在作者之前的研究中，使用 16 个新鲜切除的肌层浸润膀胱癌患者的组织进行流式细胞术来研究 TME 的 CD8 + 细胞功能和免疫抑制功能。本研究中作者重新分析以往研究的数据，确认 LAP + 细胞和 CD8 + T 细胞衰竭之间的关系 (图 3f)。我们观察了高 LAP + 细胞亚群中 CD8 + T 细胞的细胞毒作用受到影响，这些在蛋白水平上的结果与 GSEA 算法得到的结果一致，进一步说明了 LAP 高表达与 CD8+T 细胞功能耗竭正相关。

作者接下来根据 LAP/ TGFβ表达和 CD8 + T 细胞浸润水平对 TCGA 队列和中山医院膀胱癌队列进行生存分析。与高 LAP/TGFβ亚组相比，只有低 LAP/TGFβ表达的患者从 CD8 + T 细胞的高浸润中获益，OS 显著更好。这些数据表明，在膀胱癌患者中，LAP 表达与肿瘤免疫逃逸环境相关，并伴有 CD8 + T 细胞功能障碍。

4. 基于 LAP 表达和 CD8 + T 细胞浸润的 MIBC 合并分类的临床意义

基于上述结果，我们推测 LAP 相关的 CD8 + T 细胞功能耗竭与 LAP/ TGFβ高表达患者的预后差密切相关。尽管具有低表达 LAP/TGFβ并伴有高 CD8 + T 细胞浸润的患者的 OS 和 RFS 明显更好 (Fig. 4A, B)，但对于高 LAP/TGFβ表达的患者，CD8 + T 细胞浸润没有预后价值。因此，我们根据 LAP 表达和 CD8 + T 细胞浸润情况对患者进行三分法: cluster I (LAP 阳性 / TGFβ low &aCD8 + T 细胞低水平)，cluster II (LAP +/ TGFβ低)，cluster III (LAP + / TGFβ high ), 在 ZSHS 队列(图 4a) 和 TCGA 队列(图 4b)。

Kaplan Meier 分析比较了三个 cluster 的临床结果，发现 cluster II 的患者在两个队列中预后较好。同时，cluster I 和 cluster III 的患者预后无差异。膀胱癌是一种异质性疾病，具有独特的分子表型和免疫环境，药物治疗反应不一，使患者的临床结果和治疗反应性难以预测。有趣的是，作者发现 TME 分型结合分子亚型可以进一步区分膀胱癌患者的预后。

在 TCGA 队列中，分析基因突变与膀胱癌亚型 (富含间质、神经内分泌样、腔内不稳定、腔内乳头状、腔内非特异性和基底 / 鳞状) 与三个 cluster 的相关性。但是，常见基因突变在三组间没有显著性差异 (图 4c)。此外，基底 / 鳞状(Ba/Sq) 亚型在 cluster II 和 cluster III 中富集。此外，在 Ba/ sq 特征的患者中，cluster II 的预后较好。(图 4d)。此外，在 cluster I、cluster II 和 cluster III 中，免疫检查点和抗原呈递特征评分均升高 (图 4e)，提示我们的新 TME 分类可能与膀胱癌中免疫治疗的有关。然后，作者从 IMvigor210 试验中招募了另 195 名接受 PDL1 治疗(atezolizumab) 的患者来验证这一假设，结果显示 cluster III 患者对 PDL1 免疫治疗的反应最差。而 cluster II 包含了对治疗反应最强 (图 4f)。Kaplan Meier 分析证实，cluster II 的应用 PDL1 治疗后 OS 较好 (图 4g)。

总的来说, 作者的研究结果表明这种新的分类基于 LAP 表达和 CD8 + T 细胞浸润水平可用于预测膀胱癌患者的 PDL1 治疗的预后。

图 4 Clinical implication of a combined classification based on LAP expression and CD8 + T cells infiltration in MIBC.

总结

本研究中，作者对膀胱癌的 TCGA 队列和中山医院队列进行分析，发现 LAP 可以作为预测膀胱癌患者预后和免疫治疗反应的独立预后指标。此外，根据 LAP 和 CD8+ T 细胞评分的分子亚型可以预测患者的免疫检查点治疗反应以及预后，表明 LAP 在膀胱癌治疗中具有潜在的靶向性。TGFβ 耳熟能详，但是你能想它的前体蛋白 LAP 的思路嘛？当下的生信分析不断涌现的是更多深入思考后的科学问题，所以好的生信思路还是得专业人士来设计呀~

参考文献：

1. Shi M, Zhu J, Wang R, et al. Latent TGF-β structure and activation. Nature. 2011;4747351:343-349.

2. Annes JP, Chen Y, Munger JS, Rifkin DB. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol. 2004;1655:723-734.

3. Ge G, Greenspan DS. BMP1 controls TGFbeta1 activation via cleavage of latent TGFbeta-binding protein. J Cell Biol. 2006;1751:111-120.

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