我们的《单细胞文献100》活动激起了大家对单细胞的兴趣，马上交流群有朋友咨询B细胞的细分亚群，希望给出参考文献，我恰好在看新冠病毒相关单细胞数据分析文章，就给出来了这个：《Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19》
该研究的实验设计很清晰，就是5个正常人加上13个患者的血液进行单细胞转录组：
• healthy donors (HDs) (n= 5),
• moderate (n= 7),
• severe (n= 4)
• convalescent (n= 6) samples
实验设计
第一层次降维聚类分群
总共是122,542 cells，第一层次降维聚类分群是14个：
• naive-state T (naive T) cells (CD3+CCR7+)
• activated-state T (activated T) cells (CD3+PRF1+)
• mucosal-associated invariant T (MAIT) cells (SLC4A10+TRAV1-2+)
• γδ T cells (TRGV9+TRDV2+)
• proliferative T (pro T) cells (CD3+MKI67+)
• natural killer (NK) cells (KLRF1+)
• B cells (MS4A1+)
• plasma B cells (MZB1+)
• CD14+ monocytes (CD14+ mono; LYZ+CD14+)
• CD16+ monocytes (CD16+ mono; LYZ+FCGR3A+)
• monocyte-derived dendritic cells (mono DCs; CD1C+)
• plasmacytoid dendritic cells (pDCs; LILRA4+)
• plate- lets (PPBP+)
• hemopoietic stem cells (HSCs; CYTL1+GATA2+).
其umap可视化如下所示：
第一层次降维聚类分群可视化umap
这个配色其实不容易区分，虽然色彩很饱满。每个细胞亚群各自标志性基因的表达量展示，文章也做的很好，这里就不赘述。以前我们做了一个投票：可视化单细胞亚群的标记基因的5个方法，下面的5个基础函数相信大家都是已经烂熟于心了：
• VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
• FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
• RidgePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"), ncol = 1)
• DotPlot(pbmc, features = unique(features)) + RotatedAxis()
• DoHeatmap(subset(pbmc, downsample = 100), features = features, size = 3)
核心分析：细胞比例变化和差异分析
单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：
• （1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析；
• （2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析
参考：http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html
这个文章《Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19》的figures2和figures3就分别对应细胞比例差异分析和基因表达量差异分析。
各个亚群细分
首先是NK,CD4和CD8细分
第二层次降维聚类分群是：
• 6 subtypes of CD4+ T cells (CD3E+CD4+),
• 3 subtypes of CD8+ T cells (CD3E+CD8A+)
• 3 subtypes of NKT cells (CD3E+CD4–CD8A–TYROBP+).
NK,CD4和CD8细分
如上图所示，出现了第三层次降维聚类分群：
• naive CD4+ (CD4+ naive) T cell (CCR7+SELL+)
• memory CD4+ (CD4+ memory) T cell (S100A4+GPR183+)
• effector memory CD4+ (CD4+ effector memory) T cell (S100A4+GPR183+GZMA+)
• regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+)
• naive CD8+ (CD8+ naive) T cell subset (CCR7+SELL+)
• effector CD8+ T cell subsets (CD8+ effector-GZMK and CD8+ effector-GNLY),
• naive NKT (NKT naive) cells (CCR7+SELL+),
• CD56+ NKT (NKT CD56) cells
• CD160+ NKT (NKT CD160) cells
有了这些细分的生物学功能亚群，然后又可以进行核心分析：细胞比例变化和差异分析
单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：
• （1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析；
• （2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析
参考：http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html
划重点：B细胞的细分亚群
如下所示：
B细胞的细分亚群
主要是6大亚群：
• one naive B subset (MS4A1+IGHD+)
• one memory B subset (MS4A1+CD27+)
• one intermediate transi- tion memory B subset (intermediate memory B; IGHD+CD27+)
• one germinal center B subset (MS4A1+NEIL1+)
• two plasma subsets plasma B (MZB1+CD38+)
• dividing plasma B (MZB1+ CD38+MKI67+).
当然了，每个亚群各自特异性基因表达量也可视化成功。
更有意思的是，在群里跟大家交流后，提问的小伙伴居然恍然大悟，原来是他自己本来就是看过这个文献。但最开始仅仅是在朋友圈浏览了中文介绍，自己也是下载了原文pdf也是匆匆一瞥。
问题在于
没有记录笔记，其实这样的文献对我们的价值并不大，我们能用到的就是降维聚类分群和各个细分亚群标记基因啊！整理起来也非常容易，但是做过就是做过，比匆匆一瞥好太多了。
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