大家好！今天给大家介绍一篇2021年11月发表在Cancer Cell International（IF:5.722）上的文章。作者对多个GEO数据集进行分析鉴定到与PAAD患者预后显著相关的两个基因：IMUP和GPRC5A。

IMUP and GPRC5A: two newly identified risk score indicators in pancreatic ductal adenocarcinoma

IMUP和GPRC5A：胰腺癌的风险打分标记物

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摘要

背景：胰腺癌是全世界范围内的一种恶性肿瘤且治疗手段较少，本研究旨在探索胰腺癌发生发展过程中的相关基因，确定有价值的基因标志物和药物靶点。

方法：对GEO数据集进行分析鉴定正常组织和肿瘤组织的差异表达基因并进行GO和KEGG分析，使用KM分析和Cox回归分析鉴定潜在的关键基因。随后研究关键基因与免疫细胞浸润和突变的相关性。使用IHC验证关键基因的表达水平。

结果：差异分析鉴定到22491个差异基因，KM分析和Cox回归分析鉴定到GPRC5A和IMUP两个关键基因。最后研究IMUP和GPRC5A的理化性质，表达水平和突变频率，其与免疫细胞浸润水平的相关性和参与的信号通路。最后，使用免疫组化验证这两个基因的表达水平。

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流程图

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结果

1.数据集的获取和下载

从GEO数据库获取GSE数据集，分别为GSE15471,GSE16515,GSE41368,GSE43795和GSE71989。

2. PAAD和正常组织鉴定到22491个差异基因

对5个GEO数据集进行差异分析，分别鉴定到17871，13660，6779，6003和17622个DEGs（图1A-1E），共包括22491个DEGs（图1F）。作者基于基因的差异程度将DEGs分为4组，GSE15471的DEGs中有13511个DEGs差异倍数少于2倍，1503个DEGs的差异倍数大于2倍，211个DEGs的差异倍数大于4倍，38个DEGs的差异倍数大于8倍（图1A）。GSE16515中4组的DEGs分别为9379，1414，601和187（图1B）。GSE41368中4组的DEGs分别为4350，1110，358和98（图1C）。GSE43795中4组的DEGs分别为3291，1996，524和275（图1D）。GSE71989中4组的DEGs分别为11631，3084，601和187（图1E）。

图1 PAAD和正常组织的差异表达基因

3.高度变异的基因主要位于细胞外区域

为鉴定每组DEGs的潜在生物学功能，对DEGs进行GO和KEGG分析。差异倍数少于2倍的DEGs主要位于细胞核，4-8倍的DEGs主要位于细胞质而大于8倍的DEGs主要位于细胞外区域（图2A-2E），表明差异倍数越大的基因其位置倾向于向细胞外靠拢。因此，接下来重点关注差异倍数大于8倍的DEGs。共有487个DEGs的差异倍数大于8，其中有55个DEGs至少存在于3个GEOs数据集中（图2F）。

图2 DEGs的细胞定位

对这些基因中的胶原相关调控因子进行研究，KM分析表明COL1A1, COL1A2, COL5A1, COL5A2, COL10A1和COL11A1与PAAD癌相关的成纤维细胞浸润水平有关并影响患者的无复发生存（图3A-3F）。

图3基因与成纤维浸润水平和PAAD患者生存期的相关性

4.风险打分评估

对这55个基因进行SurvExpress风险评估，其C-index为77.36，风险组的风险比率为3.91并对风险组这55个基因的表达水平进行分析（图4A-4C）。

图4 KM分析鉴定关键基因

5.生存分析表明GPRC5A和IMUP是PAAD的独立预后因子

这55个基因的KM分析表明有6个基因与PAAD生存有关，分别为GPRC5A, IMUP, KYNU, MSLN, S100P和SFN（图4D-4I）。多因素Cox回归分析表明肿瘤等级，GPRC5A和IMUP表达水平是PAAD的独立预后因子（表1）。

表1多因素Cox回归分析

6. GPRC5A和IMUP基因的理化性质

作者使用ProtParam，ProtScale和Protein Atlas分析GPRC5A和IMUP的理化性质。结果表明，GPRCGA蛋白有357个氨基酸组成，分子量为40.3KD，在哺乳动物中的半衰期为30h。GPRC5A的氨基酸包括39个带负电荷的氨基酸残基和32个带正电荷的氨基酸残基，蛋白质的等电点为8.39。GPRC5A的不稳定性指数为38.49，疏水值为0.31，是一个疏水蛋白（图5A），定位于质膜和胞泡中（图5B）。

IMUP蛋白包括106个氨基酸，其中包括13个带负电荷的氨基酸残基和21个带正电荷的氨基酸残基，等电点为9.73，蛋白分子量为10.9KD，在哺乳动物中的半衰期为30h，不稳定性指数为38.42，疏水值为- 1.372，是一个亲水蛋白（图5C），定位于细胞质和质膜中（图5D）。

图5 PAAD中GPRC5A和IMUP的表达水平异常增加

7. PAAD中GPRC5A和IMUP的异常表达

GPRC5A在不同肿瘤中的表达水平不同，例如GPRC5A在肾透明细胞癌和肺鳞癌中的表达水平较低，而在PAAD等肿瘤中的表达水平较高（图5E和5F）。IMUP的表达水平与GPRC5A类似（图5H和5I）。皮尔森分析表明两个基因正相关，表明这两个基因在PAAD发育过程中可能调控类似的信号通路（图5G）。KM分析表明，GPRC5A和IMUP阳性的患者生存期最差，而阴性的换生存期最好（图5J）。IHC和qRT-PCR结果表明PAAD中GPRC5A和IMUP的表达水平较高（图5K-5O）。

8.其他类型的遗传改变分析

随后，作者分析GPRC5A和IUMP突变频率，拷贝数变异和蛋白质结构变异。结果表明，GPRC5A在不同肿瘤中基因变异的类型不同，在PAAD中扩增为主要变异类型（图6A）。对于IMUP基因中，基因变异类型少于GPRC5A基因（图6B）。发生突变的患者的总生存率，无病生存率和无进展生存率均低于未发生突变的患者。

图6 GPRC5A和IMUP基因突变和免疫细胞浸润的相关性

9. GPRC5A和IMUP基因表达与PAAD免疫细胞浸润的相关性

免疫细胞浸润水平与GPRC5A和IMUP表达的相关性分析表明，GPRC5A与CD4+ T细胞，CD8+ T细胞，B细胞，NK细胞，单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞或成纤维细胞浸润水平没有显著相关性（图6C-6J），IMUP结果与GPRC5A的结果类似（图6K-6L）。

10. GPRC5A和IMUP基因在PAAD发生中的临床意义

随后，作者研究GPRC5A和IMUP表达水平与PAAD临床病理特征的关系。肿瘤组织中GPRC5A和IMUP基因的表达水平较高（图7A-7J），且随肿瘤分期和等级的增加基因的表达水升高（图7D,7F,7M和7O）。此外，在发生淋巴结转移和酗酒的患者中GPRC5A的表达水平较高（图7I和7G），在男性和年老患者中IMUP的表达水平较高（图7L和7K）。GPRC5A和IMUP表达与患者胰腺炎状态没有显著关系（图7H和7Q）。在发生TP53突变基因的患者中GPRC5A和IMUP表达较高，表明GPRC5A和IMUP与TP53相关信号通路存在潜在关系（图7E和7N）。

图7 GPRC5A和IMUP表达水平与PAAD临床病理特征的相关性

多因素Cox分析表明GPRC5A和IMUP基因的表达水平随肿瘤等级升高而增加，此外表达水平与患者的种族，年龄，性别和转移没有显著相关性（表2和表3）。

表2 GPRC5A和PAAD临床病理特征的相关性

表3 IMUP与PAAD临床病理特征的相关性

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结论

本研究基于多个GEO数据集和生物信息工具鉴定到了22491个在PAAD和正常组织中的差异基因，并鉴定到GPRC5A和IMUP基因可以作为癌症发生发展的独立预后指标。公共数据集和IHC结果表明这两个基因在PAAD中异常上调。KM和Cox回归分析均表明GPRC5A和IMUP高表达与OS较差有关。随后，作者研究这两个基因的理化性质，变异类型和与免疫细胞浸润的相关性。本研究结果可以更好的理解PAAD发生机制并为PAAD临床治疗提供有价值的信息。本研究的局限性在于还需要大量的额外数据对GPRC5A和IMUP进行验证。

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