大家好！今天给大家介绍一篇2021年9月发表在Molecular Therapy Oncolytics（IF：7.200）上的文章。作者分析BLCA患者的RNA-seq数据并鉴定BLCA患者的缺氧反应模式，随后基于缺氧相关基因构建HPXscore，可以准确预测患者预后和免疫治疗反应。

Characterization of hypoxia response patterns identified prognosis and immunotherapy response in bladder cancer

鉴定与膀胱癌预后和免疫治疗有关的缺氧反应模式

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摘要

瘤内缺氧和免疫与肿瘤患者的预后高度相关。然而，目前上没有关于膀胱癌（BLCA）缺氧反应和免疫方面的研究。本研究，作者使用非监督一致性聚类方法研究1343例BLCA患者的缺氧反应模式和BLCA患者临床病理特征的关系。共鉴定到五种缺氧反应模式，使用LASSO-Cox回归分析构建HPXscore。HPXscore -低组的特征为免疫激活和DNA损伤修复较高，为免疫炎症表型。HPXscore -高组中基质相关通路激活，为免疫排斥表型。此外，HPXscore是独立预后因子，可以准确预测BLCA患者的免疫治疗反应。因此，本研究全面的阐述了BLCA患者的缺氧特征，有助于解释免疫逃逸的潜在机制并阐明BLCA的缺氧修饰和免疫检查点靶向免疫治疗。

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流程图

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结果

1.数据集获取和下载

从GEO数据库下载4个BLCA的RNA-seq数据集（GSE13507,GSE32548,GSE32894和GSE48075），从TCGA数据库下载TCGA-BLCA数据集。从TCGA数据库下载TCGA-BLCA的突变数据。

2. BLCA的缺氧反应模型特征

本研究的流程图如图1A所示，对GEO数据集和TCGA数据集进行一致性聚类分析共鉴定到HPX簇A-HPX簇E五个模式（图1B）。无监督层次聚类分析表明缺氧反应相关基因在HPX簇A-HPX簇E中差异表达（图1C）。KM分析表明，HPX簇A-HPX簇E之间存在生存差异（图1D），其中HPX簇D的生存较好。

图1缺氧反应相关基因的一致性聚类

3.不同缺氧反应模式的TME免疫细胞浸润差异

为鉴定缺氧反应模式与TME的相关性，使用ssGSEA算法计算TME免疫细胞浸润水平。各个HPX簇TME免疫细胞浸润水平的聚类热图如图2A所示。HPX簇A的活化B细胞，B细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，树突状细胞和未成熟树突状细胞的浸润比例较高，HPX簇B的免疫细胞浸润水平与HPX簇A类似，HPX簇C中的免疫细胞浸润水平较低，但T记忆细胞，T辅助细胞和CD56自然杀伤细胞的浸润比例较高，HPX簇D中的活化CD4细胞，CD8细胞和DC细胞浸润比例较高。Pearson相关性分析表明Treg细胞与所有免疫细胞正相关。

4.不同缺氧反应模式的生物学过程特征

作者使用ssGSEA研究五种模式的生物学过程。如图2B所示，HPX簇A富集在转化生长因子（TGF）-β信号通路，WNT信号通路和NOTCH信号通路。HPX簇B与HPX簇A的功能类似。HPX簇C富集在癌症相关通路，包括mTOR和TP53信号通路。HPX簇D富集在免疫激活相关通路，包括抗原加工，趋化因子信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用。HPX簇E富集在DNA损伤修复相关通路。ssGSEA分析表明基质相关信号包括血管生成，上皮-间质转化（EMT）和泛成纤维细胞TGF-β反应通路在HPX簇A中富集（图2C）。此外，作者发现HPX簇D显著富集CD8 T效应细胞，抗原呈递基质和免疫检查点特征（图2C）。此外，作者发现HPX簇D中MHC分子，共刺激分子和粘附分子表达水平较高（图2D）。结果表明，五种缺氧反应模式具有不同免疫细胞浸润特征，其中HPX簇A和HPX簇B是免疫- excluded表型，HPX簇D是免疫- inflamed表型，HPX簇C和HPX簇E是免疫- desert表型。

图2 TME免疫细胞浸润和生物学过程特征

5. TCGA-BLCA队列的缺氧反应模型

作者对TCGA-BLCA队列进行一致性聚类分析同样鉴定到5个HPX簇，其中HPX簇C和HPX簇E与预后较好有关，HPX簇A和HPX簇B与预后较差有关（图3A）。随后，作者研究HPX簇与临床病理特征的相关性。HPX簇的TNM分期和治疗结果没有显著差异。然而，HPX簇C和HPX簇E为无肿瘤和CR/PR的患者更多。免疫细胞浸润分析发现，HPX簇C免疫细胞浸润水平显著低于HPX簇E（图3B）。此外，HPX簇C的活化DCs和DC浸润水平较高，MHC分子，共刺激分子和粘附分子表达水平较高（图3C）。此外，通路分析表明HPX簇E富集在免疫激活和抗原处理相关通路，HPX簇A富集在基质信号（图3D）。ssGSEA分析表明HPX簇E富集在DNA损伤修复信号通路，而TFG-β，WNT，p53，mTOR和PPAR信号通路失活。对HPX簇A-HPX簇E进行差异分析，对DEGs进行GO分析。HPX簇A的DEGs富集于角质细胞分化和角质化，HPX簇C中的DEGs富集于上皮发育相关通路，HPX簇E中的DEGs富集于免疫激活相关通路（图3E）。

图3 TCGA-BLCA队列的缺氧反应模式特征

6.不同缺氧反应模式的肿瘤体细胞突变

作者对TCGA-BLCA队列的体细胞突变数据进行分析，突变频率排名前30的突变基因瀑布图如图4A所示。HPX簇E的突变频率最高，尤其是TP53和RB1。此外，HPX簇E与TMB较高有关，而HPX簇B的TMB最低。HPX簇E的碱基切除修复，DNA损伤修复和错配修复等信号通路富集程度较高（图4C）。

图4不同缺氧反应模式的体细胞突变情况

7.构建缺氧表型相关的预后模型

作者首先合并各个分组的差异基因共得到2257个DEGs并进行单因素Cox回归分析，筛选到394个基因。随后进行LASSO-Cox回归分析，最终得到12个基因构建缺氧相关预后模型（HPXscore）。根据HPXscore中位数将患者分为HPXscore -高和HPXscore -低组。KM分析表明HPXscore -低组的生存情况较好（图5A）。HPX簇A的HPXscore最高而HPX簇E的HPXscore最低（图5B）。功能注释分析表明HPXscore -低组患者富集于免疫激活信号而HPXscore -高组患者富集于基质通路（图5C）。HPXscore和相关功能的Pearson相关性分析如图5D所示。以上结果表明，HPXscore -低与免疫激活显著相关，而HPXscore -高与基质激活显著相关。HPXscore与临床病理特征相关性分析表明，HPXscore -高与TNM分期较高，淋巴结侵袭和死亡状态有关，而HPXscore -低的结果相反（图3B）。已有研究将BLCA患者分为不同分子亚型，HPXscore -低患者为luminal，luminal papillary，TCGA Ⅰ/Ⅱ，UroA和GU亚型的数量更多，而HPXscore -高患者为基底，基底鳞状，TP53样，TCGA Ⅲ/Ⅳ和SCC-list亚型的数量更多（图5E和5F），桑基图如图5G所示。GU亚型患者的HPXscore最低（图5E）。此外，HPXscore -低组中GU亚型患者的数量是HPXscore -高组中的两倍（图5F）。随后，作者分析HPXscore -低和HPXscore -高组的体细胞突变差异。HPXscore -低组中PI3KCA,KMT2D和FGFR3突变频率较高，而TP53和RB1突变没有显著差异（图5J）。此外，作者发现HPXscore与TMB显著负相关（图5H）。KM分析表明，无论TMB高组和TMB低组均是HPXscore -低的患者生存期较好（图5I）。

图5 HPXscore的转录组和生物学特征

8. HPXscore可以作为BLCA的独立预后因子

单因素和多因素Cox回归分析表明，HPXscore，TMB，T分期，N分期和年龄是BLCA患者的独立预后因子（图6A和6B）。作者基于以上因子构建列线图用于预测BLCA患者的生存期（图6C）。校准图和DCA图表明列线图的准确度（图6D-6G）。

图6 HPXscore可以作为独立预后因子

9. HPXscore是预测ICI免疫治疗临床反应的生物标志物

作者使用IMvigor210队列研究HPXscore预测免疫治疗反应的作用。KM分析表明，HPXscore -低组的总生存期较好（图7A）。功能注释结果表明，HPXscore -低组显著富集免疫激活特征，而HPXscore -高组显著富集基质特征（图7B）。相关性分析表明HPXscore与免疫激活相关和错配修复相关特征负相关，而与基质相关特征正相关（图7C），GU亚型和Ⅱ亚型的HPXscore最低（图7D）。HPXscore -低组的GU亚型患者数量是HPXscore -高组的三倍（图7E）。桑基图如图7F所示。

图7 IMvigor210队列的HPXscore特征

此外，IMvigor210队列的TMB与HPXscore显著负相关（图8A和8B）。KM分析表明HPXscore -低/ TMB -高组的总生存期较好（图8C）。HPXscore -低组免疫激活，免疫检查点和MHC分子相关基因高表达而TGF-β-EMT通路相关基因低表达（图8D和8E）。HPXscore -低组免疫- inflamed表型的患者数量较多（图8F）。HPXscore -高组与免疫- excluded和免疫- desert表型显著相关（图8G）。此外，HPXscore较低的患者更易受益于ICI免疫治疗（图8I），对ICI治疗有反应的患者比例更高（图8H）。作者发现结合TMB和HPXscore可以提高预测患者受益于免疫治疗的反应比例（图8J）。以上结果表明，缺氧反应模式与TME免疫表型显著相关，HPXscore有助于预测个体对ICI免疫治疗的反应。

图8 HPXscore预测ICI免疫治疗反应

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结论

总的来说，作者构建的HPXscore可以评价BLCA患者的低氧反应模式，且与临床病理特征，免疫细胞浸润水平，突变情况和分子特征有关。此外，HPXscore可以作为BLCA患者的独立预后因子并且可以预测ICI免疫治疗的临床反应。本研究为BLCA患者的临床治疗提供有价值的信息。本研究的局限性在于还需要一定的实验验证HPXscore的准确性。

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