大家好！今天给大家介绍一篇2021年9月发表在Oncogene（IF:9.867）上的文章。作者使用WGCNA鉴定到与膀胱癌免疫治疗有关的基因模块并构建了预测ICB预后和反应的模型。
CD8+ T effector and immune checkpoint signatures predict prognosis and responsiveness to immunotherapy in bladder cancer
CD8+ T效应因子和免疫检查点预测膀胱癌预后和免疫治疗反应
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摘要
免疫检查点阻断已应用于治疗膀胱癌，但是仅有少数患者受益于免疫治疗。本研究，作者对IMvigor210队列的348例转移性尿路上皮癌样本进行分析鉴定与CD8+ T效应因子和免疫检查点显著相关的基因。构建免疫检查点阻断打分（IMS）模型预测免疫治疗反应。转录组分析表明IMS -高组的免疫激活显著，预后较好，免疫治疗反应较高，可以作为预测ICB预后和反应的潜在生物标志物。对2031例膀胱癌样本计算TIDE打分，筛选到可以作为潜在治疗靶点的核心基因，并使用多组学数据对这些基因进行验证。此外，作者构建风险预测模型可以将膀胱癌患者分为高风险组和低风险组，并预测患者的预后和ICB治疗反应。总的来说，本研究鉴定到了可以预测膀胱癌ICB治疗反应的标志物并提供新的免疫治疗靶点。
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流程图
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结果
1.构建WGCNA和鉴定关键模块
首先，作者对IMvigor210队列的348例mUC样本进行分析，获得2351个基因进行WGCNA。WGCNA鉴定到5个模块（图1A），其中黄色模块与CD8+ T效应因子（Teff）和免疫检查点特征有关（图1B），表明黄色模块中的基因可能在PD-L1 ICIs的临床预后中起到重要作用。因此，作者对黄色模块中的基因进行相关性分析，黄色模块中的基因与CD8+ Teff和免疫检查点的相关性较强（图1C和1D）。GO分析表明黄色模块中基因主要富集于T细胞激活，质膜外侧和细胞因子受体结合等功能（图1E）。KEGG分析表明黄色模块中基因主要富集与细胞因子-细胞因子受体互作和趋化因子信号通路（图1F）。
图1 WGCNA分析
2. IMS作为预测因子的潜在生物学作用
作者使用ssGSEA对黄色模块中的513个基因构建打分系统- IMS，用于定量每个样本的预后水平。为了研究IMS对膀胱癌患者抗PD-L1免疫治疗的机制，作者绘制聚类热图可视化IMS与Lund分类，TCGA分类的相关性（图2A）。IMS低组中亚型I最为常见而亚型Ⅳ最少，对于Lund分类来说，IMS低组中亚型UroA比例最高，IMS高组中亚型Inf比例最高（图2A）。IMS高组和IMS低组存在大量显著差异基因，FGFR3在IMS低组中高表达而CD8 Teff特征在IMS高中高表达。生存分析表明，IMS低组的预后较差（图2B）。此外，应答组的IMS较低（图2C）。随PD-L1表达水平的增加，IMS显著增加（图2D），不同免疫表型的IMS同样存在显著差异（图2E）。
图2 IMS的潜在生物学作用
3. IMS的免疫治疗反应
为进一步了解IMS预测免疫治疗反应的功能，作者使用TIDE算法分析2031个膀胱癌样本（图3A）。IMS与TAM M2和MDSC水平负相关，与CAF正相关。IMS与免疫细胞相关性分析表明，IMS与大多数免疫细胞正相关（图3B）。此外，作者发现在IMS高和IMS低组中有多种免疫细胞类型存在差异（图3C）。IMS与膀胱癌有关的生物学通路的基因打分进行相关性分析，IMS与免疫检查点，CD8 T效应因子，APM，EMT1和EMT3打分正相关，与FGFR3和TCGA打分负相关（图3D）。此外，IMS高组的肿瘤纯度较高，IMS低组的免疫打分和基质打分较高（图3E）。
图3 IMS的免疫治疗反应
4.鉴定核心基因和预后评估
为探索潜在的免疫治疗靶点，作者使用Cytoscape鉴定黄色模块中最重要的核心基因（图4A）。其中CD274和HAVCR2是已知的免疫检查点。作者发现核心基因可能与膀胱癌细胞凋亡，EMT和ER激素信号通路，抑制PI3K/Akt通路，DNA损伤反应等有关（图4B）。生存分析表明，B2M和CD274高表达的患者生存期较长而CD300A高表达的患者生存期较短（图4C）。随后，作者重点研究B2M与膀胱癌免疫浸润的相关性。免疫组化分析表明B2M在肿瘤组织中的表达水平较高（图4D）。使用多色免疫荧光染色法研究B2M与肿瘤微环境的相关性（图4E-4H）。B2M +细胞数量随远离肿瘤细胞而减少（图4F和4H）。距离B2M +细胞越远，CD8+ T细胞和CD68 +巨噬细胞的数量逐渐减少（图4F和4I）。此外，膀胱癌组织中还鉴定到B2M+CK +细胞，B2M+CD8 +细胞和B2M+CD68 +细胞（图4J）。
图4鉴定核心基因
5.构建和验证风险预测模型
作者将IMvigor210队列随机分为训练集和验证集，对黄色模块基因进行单因素和LASSO Cox回归分析鉴定到包含8个基因的风险预测模型（图5A和5B）。根据风险打分中位数将患者分为高风险组和低风险组。高风险组的死亡率明显高于低风险组（图5C和5D）。使用KM分析评估风险模型的预后价值（图5E和5F），训练集和验证集1年ROC曲线的AUC分别为0.767和0.638，3年和5年分别为0.835和0.719（图5G和5H）。此外，单因素Cox回归分析表明风险打分与OS显著相关（图5I），多因素Cox回归分析表明风险打分是独立风险因子（图5J）。
图5构建和验证风险预测模型
6.风险预测模型基因的预后价值评估
此外，作者分析了风险模型中8个基因的表达水平，其中CXCL13和LAG3的表达水平在CR/PR中较高，而ZYX和TLR2的表达水平较低（图6A）。免疫组化分析表明CXCL13在肿瘤组织中的表达水平较高（图6C），多色荧光染色表明CXCL13与膀胱癌肿瘤免疫微环境相关性较强（图6D-6H）。膀胱癌组织中存在CXCL13+CK +细胞、CXCL13+CD8 +细胞和CXCL13+CD68 +细胞(1.77%)(图6G)。距离肿瘤细胞越远，CXCL13 +细胞数量越少（图6F和6H），肿瘤癌巣中CXCL13 +细胞数量较低（图6I），距离CXCL13 +细胞越远，CD8+ T细胞和CD68+巨噬细胞的数量越少（图6F和6J）。
图6风险模型中基因的特征
7.风险预测模型基因的泛癌分析
作者研究30种癌症中风险预测模型中8个基因表达水平与CNV的关系，其中在大多数癌症中ZYX，TLR2和SPHK1的表达受到CNV的调控。随后，作者分析了33种癌症中这8个基因的纯合CNV /杂合CNV比例，在OV和食管癌以纯合为主而在腺样囊性癌中以杂合为主。结果表明，不同癌症中风险预测模型相关基因的CNV不同。基因的表达水平分析表明，KIRC组织中基因的表达水平较高，SPHK1,UBD和LAG3在LUSC中的表达水平较高，而TLR,MEFV,ZYX和TNFSF14在正常组织中的表达水平较高。
8.构建列线图
使用单因素Cox和多因素Cox回归分析基于风险打分，同源重组，IC水平，免疫检查点效应因子，DDR等构建列线图，可以预测膀胱癌患者ICI治疗后的生存率（图7A）。校准图和DCA表明列线图的准确性较高，具有较高的临床应用潜力（图7B-7E）。
图7列线图
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结论
本研究作者使用WGCNA分析获得与免疫治疗最相关的基因模块并构建膀胱癌的免疫治疗预测模型和打分系统，俄日膀胱癌预后提供可靠的生物标志物并预测免疫治疗反应。进一步的研究验证了膀胱治疗的潜在靶点并为膀胱癌免疫治疗提供了新的临床策略。然而，本研究的局限性在于由于样本收集较为困难作者并没有进行额外的外部验证。
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