大家好！今天给大家介绍2021年12月发表在Molecular Therapy: Nucleic Acid（IF：8.886）上的一篇文章。本研究作者对骨肉瘤中的m6A修饰因子进行生物信息分析和实验验证，结果表明RBM15可以作为预测骨肉瘤转移和预后的有效生物标志物。

Analysis and identification of m6A RNA methylation regulators in metastatic osteosarcoma

分析和鉴定转移性骨肉瘤中的m6A RNA甲基化调控因子

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摘要

骨肉瘤（OS）的特点是快速生长和早期转移，然而其机制尚不清楚。N6 -甲基化（m6A）修饰和调控因子在OS等大多数癌症中发挥重要作用。本研究中，作者使用TARGET数据库筛选到21个m6A修饰因子并鉴定关键的m6A甲基化修饰因子。结果表明有3个m6A甲基化调控因子RBM15,METTL3和LRPPRC的表达水平与OS患者的生存率较低有关。使用单因素和多因素Cox回归分析鉴定独立预后因子，转移是OS患者的独立预后因子。此外，作者发现RBM15与转移性OS有关，作者通过实验验证证明RBM15可以促进骨肉瘤细胞的侵袭，迁移和转移。总的来说，RBM15与OS转移和患者生存率较低有关，RBM15可以作为预测OS患者转移和预后的生物标志物。

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流程图

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结果

1.数据集的获取和下载

从TARGET数据库获取88例OS患者的转录组数据集和临床数据集（表1）。

表1 OS患者的临床数据集

2. m6A调控因子的交互作用和相关性

由于m6A调控因子在肿瘤的发生发展中起到重要作用，作者对88例OS患者的21个m6A调控因子的数据进行全面分析。作者首先使用PPI网络分析这21个m6A调控因子的交互作用，结果表明有5个调控因子与其他调控因子的交互作用最高（图1A），且相关节点最多（图1B）。此外，使用皮尔森相关研究这21个调控因子的相关性，结果表明FTO与ALKBH5和RBM15负相关，而FTO与METTL3,METTL14和WTAP正相关。WTAP与METTL3和METTL14正相关。然而HNRNPC与其他调控因子相关性较差（图1C）。GO分析表明大部分调控因子富集到调控mRNA甲基化过程和调控mRNA稳定性（图1D）。

图1 21个m6A调控因子的交互作用和相关性

3.基于调控因子表达水平的一致性聚类

为研究m6A调控因子表达水平与OS患者预后的相关性，作者进行一致性聚类，共聚为3类（图2A和2B）。此外，根据组间的相关性表明样本可以分为3类（图2C）。对这3类进行生存分析表明这3类的生存情况具有显著差异（图2D）。此外，比较这3类的临床特征差异，发现这3类并没有显著差异。然而，这三类的m6A调控因子具有显著差异（图2E）。

图2 m6A调控因子的一致性聚类

4.与OS预后较差的关键m6A调控因子

对这21个m6A调控因子进行生存分析进而筛选关键的调控因子。如图3A所示，有3个调控因子RBM15,METTL3和LRPPRC的p值最小且HR最大。RBM15,METTL3和LRPPRC的高表达与生存期较差有关，表明这3个调控因子是OS的高风险因子。此外，作者进行了LASSO Cox回归分析（图3B和3C）。

图3筛选3个关键的m6A调控因子

5.基于3个m6A调控因子构建生存模型

基于上面构建的风险打分将患者分为高风险组和低风险组。风险打分分布，生存时间和状态以及RBM15,METTL3和LRPPRC的表达水平如图4A所示。RBM15,METTL3和LRPPRC在高风险组中高表达。高风险组和低风险组的总生存期具有显著差异，高风险组的预后较差（图4B）。ROC曲线的AUC如图4C所示，1年，3年和5年的AUC均大于0.7。高风险组和低风险组的肿瘤位置，转移状态，年龄和性别没有显著相关性（图4D）。单因素Cox回归分析表明患者预后与转移，风险打分和聚类具有相关性而与性别，年龄和肿瘤位置没有相关性（图4E）。多因素Cox回归分析表明转移与预后显著相关（图4F）。

图4构建预后模型

6.在转移OS和非转移OS样本的m6A调控因子的表达水平

TARGET数据库获取的OS数据集共包括66例转移样本和22例非转移样本。RBM15和WTAP在转移样本中显著上调表达。然而，进一步研究表明只有RBM15在转移样本中显著过表达（图5）。说明，RBM15可能是关键的调控因子，在OS转移机制中具有重要作用。

图5 21m6A调控因子表达水平

7. RBM15在其他癌症中的表达水平

作者使用Oncomine数据库研究RBM15在不同类型OS中的拷贝数，RBM15在四个OS亚型中的拷贝数增加时间频率较高，表明RBM15在OS中的关键作用。此外，作者研究RBM15在其他癌症中的表达水平，RBM15在一些肿瘤中高表达。

8.RBM15突变分析和与免疫细胞浸润的相关性

作者使用SARC突变数据分析RBM15的突变状态。RBM15的体细胞突变频率为0.84%（图6A）。此外，使用CCLE数据库预测不同OS细胞系中RBM15中的甲基化状态（图6B）。此外，作者使用PPI网络构建RBM15的蛋白质相互作用，RBM15与RRN3和DIDO1相互作用。RBM15与这两个调控因子正相关。使用TIMER数据库研究免疫细胞浸润水平。如图6C所示，RBM15表达水平与CD4 T细胞，巨噬细胞和树突状细胞浸润水平负相关。这些结果表明RBM15在OS的免疫细胞浸润中起到重要作用。

图6 RBM15的突变状态，甲基化位置和免疫细胞浸润相关性

9.验证转移OS细胞系和人类临床样本中RBM15的表达水平

作者使用qRT-PCR和western研究RBM15在转移和未转移OS细胞系中的表达水平。图7A所示，在转移OS细胞系中RBM15的表达水平较高。western blot结果与之一致（图7B）。此外，作者使用IHC研究人类临床样本中RBM15的表达水平。如图7C所示，转移OS样本中RBM15蛋白表达水平较高。在转移OS细胞系中敲除RBM15（MNNG细胞系），在非转移性OS异细胞中转染表达载体RBM15（HOS细胞系）。如图7D和7E所示，在HOS细胞系的RBM15的表达水平明显增加，而MNNG细胞系中RBM15的表达水明显降低（图7F和7G）。

图7使用OS细胞系和人类临床样本验证RBM15的表达水平

10. RBM15促进OS细胞的迁移，增殖和转移

作者使用Transwell迁移实验研究RBM15在转移OS中的潜在调控作用。如图8A所示，在过表达RBM15后HOS细胞的迁移能力显著增加。在MNNG细胞中敲除RBM15后迁移能力降低。此外，过表达RBM15后HOS细胞的侵袭能力同样增加。此外，划痕实验结果表明过表达RBM15的HOS细胞治愈效果较好，而MNNG细胞的治愈效果较差（图8B）。图8C所示，过表达RBM15显著增加了非转移性OS细胞株的形成能力，而沉默RBM15显著破坏了OS细胞株的形成能力。CCK-8实验表明RBM15对维持OS细胞的高增殖了具有关键作用，过表达和敲除RBM15会显著增强和抑制OS细胞的活力（图8D）。作者将敲除RBM15的MNNG细胞注射到小鼠静脉，4周后采集小鼠组织进行分析。如图8E所示，与对照组相比处理组的小鼠OS细胞肺转移效果较低。总的来说，这些结果表明RBM15在OS细胞的运动和迁移中发挥重要作用。

图8验证RBM15的侵袭，迁移，增殖和转移能力

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结论

总的来说，作者分析了骨肉瘤中21个m6A调控因子的表达水平和预后价值。鉴定到3个关键m6A调控因子与OS的预后有关并构建预后模型。此外，作者鉴定到RBM15与骨肉瘤的转移有关并使用实验进行验证。结果表明RBM15在OS的发展和转移中起到重要作用，可以作为预测OS转移和预后的关键生物标志物。

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