大家好！今天给大家介绍一篇2021年11月发表在BMC Medicine（IF:8.775）上的一篇文章。作者对多个BLCA的转录组数据集的5mC调控因子进行分析，构建5mC打分系统，可以将BLCA进行分型，预测预后和预测免疫治疗反应。

5mC regulator-mediated molecular subtypes depict the hallmarks of the tumor

microenvironment and guide precision medicine in bladder cancer

5mC调控因子介导的分子亚型阐明膀胱癌的肿瘤微环境特征并指导精准医疗

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摘要

背景：阐明肿瘤微环境（TME）异质性和功能特点是膀胱癌精准医疗的必要条件。尽管已有的分子亚型可以反映TME的异质性和特征，但其临床应用还有一定限制。

方法：本研究整合湘雅数据集和多个BLCA数据集构建5mC调控因子介导的分子亚型系统——5mC打分。使用无监督聚类鉴定5mC调控因子介导的分子亚型，使用PCA计算5mC打分。随后，将5mC打分与BLCA的分子亚型，免疫表型，临床结果和治疗结果相关联。

结果：共鉴定到2个5mC簇，5mC簇1和5mC簇2。5mC打分可以准确预测BLCA的分子亚型，免疫表型，预后和治疗结果。5mC簇1是腔内亚型和非炎症表型，抗肿瘤免疫较低但预后较好。5mC簇1对癌症免疫治疗，新辅助化疗和放疗敏感性较低但对抗血管生成治疗和靶向治疗敏感性较高。

结论：基于5mC调控因子的分子亚型系统可以反映BLCA的生物学特征，为BLCA的精准医疗提供新的见解。

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流程图

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结果

1.数据集的获取和下载

本研究包括湘雅数据集，包括57个BLCA样本和13个正常样本。从TCGA数据库获取BLCA数据集，包括400个样本。从GEO数据库获取BLCA数据集，GSE48075和GSE32894。从European Molecular Biology Laboratory数据库获取E-MTAB-4321数据集，包括476个样本。从imvigor210数据库获取IMvigor210数据集，包括348个样本。从GEO数据库下载3个免疫治疗数据集，分别为GSE135222,GSE78220和GSE91061。从TIDE下载6个免疫治疗数据集。

2. BLCA中5mC调控因子分析

5mC由多种不同调控因子介导，在多种癌症的生物过程中发挥关键作用。在TCGA-BLCA数据集中，膀胱癌组织中5mC调控因子显著高表达。对湘雅数据集的单细胞转录组数据进行分析，鉴定到7种细胞类型，包括癌细胞，T细胞，iCAF，mCAF，髓样细胞，B细胞和内皮细胞。大多数5mC调控因子在癌细胞中表达而有6个5mC调控因子在癌细胞和非癌细胞中表达。

3.鉴定5mC簇

图1A为TCGA-BLCA数据集5mC调控因子的预后价值，相关性及其亚型。使用无监督聚类根据21个5mC调控因子将TCGA-BLCA数据集分为两个簇。图1B为5mC簇和临床病理特征的相关性。5mC簇1的预后较差（图1C）。多因素Cox回归分析表明5mC簇是一个独立预后因子（图1D）。

图1 TCGA-BLCA数据集中5mC簇的临床相关性

4.构建5mC基因特征，5mC打分和功能分析

在5mC簇1和5mC簇2中鉴定到401个DEGs，显著差异表达的DEGs是BLCA分子亚型特异性标记物。其中KRT6A、KRT6B、KRT6C、KRT5、KRT14、SERPINB3、SERPINB13、SERPINB4和DSG3是BLCA亚型的标志物，UPK1A、UPK2、UPK3A、KRT20和SNX31是腔内亚型标志物。对DEGs进行富集分析其中白细胞趋化，髓系白细胞迁移，趋化因子/细胞因子受体结合和MHC蛋白复合物显著富集，细胞因子-细胞因子受体互作和趋化因子信号通路显著富集。在这些DEGs中有88个DEGs具有预测价值，根据这88个DEGs进行PCA计算5mC打分。根据5mC阈值将TCGA-BLCA分为5mC打分-高组和5mC打分-低组。5mC打分-高组的预后较好。5mC簇1为5mC打分-高组而5mC簇2为5mC打分-低组。

5. 5mC簇可以用于BLCA分子亚型分类并预测BLCA的治疗方法

图2A和2B为5mC聚类，5mC打分和7个分子亚型分类之间的相关性。5mC打分-高组和5mC簇1为腔内亚型，其特征为腔内分化，尿路上皮分化和Ta通路。5mC打分-低组和5mC簇2为基础亚型，其特征为基础分化，EMT分化，免疫分化，干扰素应答和角化。ROC曲线表明5mC打分预测经典分子亚型的准确率较高（图2C）。5mC打分-低组新辅助化疗相关基因的突变频率高于5mC打分-高组（图2D和2E），说明5mC打分-低组患者对新辅助化疗更敏感。5mC打分-低组患者对EGFR靶向治疗和放疗效果更敏感（图2F）。5mC打分-高组的一些免疫抑制致癌通路显著富集，包括WNT-β-catenin网络，PPARG网络，FGFR3网络等。因此，靶向这些致癌通路可能为5mC打分-高组患者提供治疗方法。使用DrugBank数据库验证上述结果（图2G）。总的来说，5mC簇可能预测BLCA分子亚型，5mC簇和5mC打分可以预测BLCA的治疗反应。

图2 5mC簇预测分子亚型和治疗方法

6. 5mC簇的甲基化模式

在5mC簇1和5mC簇2鉴定到49904个DMP，包括142个5mC簇特异性DMPs。5mC打分与5mC簇特异性DMP的甲基化水平负相关。此外，5mC打分与癌症相关基因启动子甲基化水平的相关性分析表明，5mC打分与这些基因启动子甲基化水平负相关。随后，作者鉴定到592个BLCA特异性高甲基化探针和465个BLCA特异性低甲基化探针并进行无监督聚类。然而，BLCA特异性DMP与预后无关。

7. 5mC打分预测BLCA中ICB的免疫表型和临床反应

大多数免疫调控因子在5mC簇1中下调表达。由于肿瘤免疫循环的活性取决于免疫调控因子的性能，在5mC簇1中大多数肿瘤免疫循环活性下调。例如，肿瘤细胞抗原，CD8 T细胞招募，CD4 T细胞招募，巨噬细胞招募，Th1细胞招募等（图3A）。此外，这些BLCA肿瘤微环境中的CD8 T细胞，CD4 T细胞，NK细胞，Th1细胞和巨噬细胞浸润水平下降（图3B和图3C）。以上结果表明5mC簇1可能是非炎症表型。

图3 5mC簇和5mC打分与免疫表型的相关性

作者进一步研究5mC簇和ICB反应的相关性。PD-L1,PD-1和CTLA-4在5mC簇1中下调表达（图4A）。5mC簇1中阳性ICB反应相关特征的富集分数和TIS低于5mC簇2（图4B和4C）。因此，5mC簇1对ICB不敏感。在BLCA肿瘤微环境中，5mC打分与抗肿瘤免疫负相关。在5mC打分-高组大多数免疫调控因子下调表达。5mC打分与大多数癌症免疫循环活性负相关（图3D）。5mC打分与CD8 T细胞，CD4 T细胞，NK细胞，Th1细胞，巨噬细胞和DCs及其效应基因负相关（图3D和3E）。此外，5mC打分与TIS，阳性ICB反应相应特征富集打分和免疫检查点显著负相关（图4D和4E）。

图4 5mC簇和5mC打分与ICB反应的相关性

8. 5mC簇中基因融合模式

在TCGA-BLCA数据集中，最常见的基因融合包括FGFR3-TACC3融合，TGB6-LOC100505984融合，AFF1-PTPN13融合，PPARG-SYN2融合，GPR110-TNFRSF21融合和TSEN-PPARG融合。其中，FGFR3-TACC3融合和AFF1-PTPN13融合主要发生于5mC打分-高组，而ITGB6-LOC100505984融合主要发生于5mC打分-低组。

9.在BLCA免疫治疗队列中，5mC打分在免疫表型分型和ICB临床反应中的作用

在IMvigor210队列中，5mC打分-高组患者预后较好。根据PD-L1在免疫细胞和肿瘤细胞中的表达水平和CD8 T细胞在TIM中的浸润状态将患者分为多个亚组。在IC0和TC0亚群中5mC打分最高。此外，5mC打分与TIS和免疫检查点表达水平负相关。接下来，作者分析免疫表型亚组的5mC打分与ICB反应之间的相关性。在deserted表型中，5mC打分-高组的ICB应答率较低。然而excluded和inflamed表型的结果与之相反。

10.湘雅数据集验证5mC打分的作用

对湘雅数据集进行分析，5mC打分可以准确预测分子亚型（图5A），ROC曲线如图5B所示。5mC打分与多个抗肿瘤免疫活性负相关（图5C）。5mC打分与CD8 T细胞，NK细胞，Th1细胞，DCs和巨噬细胞的浸润水平负相关（图5F）。5mC打分与免疫检查点，TIS，阳性ICB应答特征富集打分负相关（图5D，图5E和图5G）。

图5湘雅数据集的验证

11. 5mC打分的泛癌分析

作者进一步评估了5mC打分在癌症中的作用。5mC打分与多种癌症类型的预后有关。在大多数癌症类型中，5mC打分与PD-L1,PD-1,CTLA-4和LAG-3的表达水平负相关。大多数癌症类型中5mC打分与TMB，MSI和干性指数相关。

12. 5mC打分可以预测免疫治疗反应

作者对9个免疫治疗数据集进行分析，研究5mC打分在免疫治疗反应中的作用。在8个免疫治疗数据集中5mC打分与免疫检查点表达水平负相关。5mC打分-高组的ICB应答率较低且5mC打分的预后较差（图6A-6H）。

图6 5mC打分预测免疫治疗反应

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结论

本研究对BLCA的多个转录组数据集的5mC调控因子进行全面分析，构建了5mC打分系统可以将BLCA患者进行分型。此外5mC打分与患者预后，肿瘤微环境特征和免疫治疗反应均有一定相关性。本研究的亮点在于本研究纳入了作者收集的独立数据集，然而还需要一定的实验验证本研究的结果。

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