大家好！今天给大家介绍一篇2021年Cancer Immunology,Immunotherapy（IF：6.968）上的文章。作者对TCGA-PAAD数据集进行全面分析鉴定到基因PLAU可以作为潜在的PAAD的治疗靶点和预测预后的标志物。
Identification of prognostic genes in the pancreatic adenocarcinoma immune microenvironment by integrated bioinformatics analysis
生物信息学分析鉴定胰腺癌免疫微环境中的预后基因
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摘要
目的：胰腺癌（PAAD）是最常见的致死类肿瘤之一，其发病机制尚不清楚。本研究旨在基于免疫微环境的生物信息分析阐明免疫/基质相关基因在PAAD预后中的价值，并使用额外数据进行验证。
方法：从TCGA数据库中获取胰腺癌患者的基因表达谱数据，基于ESTIMATE算法鉴定差异表达基因（DEGs）。利用WGCNA构建基因共表达网络。在关键模块中使用生存分析揭示预后价值。随后进行功能富集分析构建PPI网络。使用TIMER和CIBERSORT研究核心基因和肿瘤免疫浸润的相关性。最后，使用GEO数据集和中国胰腺癌患者数据进行验证。
结果：在TCGA-PAAD队列中，低免疫/基质打分与预后较好有关。生物信息分析表明有57个基因与胰腺癌预后显著相关。其中COL6A3，PLAU，MMP11和MMP14基因的上调与预后不良有关且与多种免疫细胞浸润有关。免疫组化结果表明中国胰腺癌患者组织的PLAU蛋白水平显著高于癌旁组织且与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关。
结论：总的来说，本研究表明PLAU可能作为一种新的诊断和治疗靶点，其在肿瘤组织中高表达且与淋巴结转移有关。
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流程图
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结果
1.数据集的获取和下载
从TCGA数据库获取PAAD的转录组数据，从GEO数据库获取GSE78229和GSE85916数据集。
2.免疫和基质打分与总生存期的相关性
TCGA-PAAD队列共包括177例样本，年龄在35-88之间，有97例男性和80例女性。对每个样本计算免疫打分，基质打分和ESTIMATE打分，免疫打分在- 1559.87-3037.78之间，基质打分在- 1843.32-2179.19之间，ESTIMATE打分在- 3178.36-4435.59之间。根据打分将PAAD患者分为打分高组和打分低组并进行KM分析，结果表明免疫打分较低的患者预后较好（图1A）。
图1免疫打分与总生存期的相关性
3.基于免疫打分和基质打分鉴定DEGs
对高/低免疫打分组和高/低基质打分组进行差异分析，免疫组鉴定到1760个上调基因和155个下调基因（图2A），基质组鉴定到1670个上调基因和129个下调基因（图2B）。DEGs的聚类热图如图2C和2D所示。将两组DEGs取交集得到1433个上调基因和67个下调基因（图2E和2F）。
图2基于PAAD的免疫/基质打分鉴定DEGs
4. DEGs的功能富集分析
对DEGs进行GO和KEGG富集分析，DEGs主要富集在补体激活，受体介导的细胞内作用，抗原结合和免疫球蛋白受体结果。DEGs主要富集于吞噬小体，细胞因子-细胞因子受体互作和趋化因子信号通路。
5. WGCNA和鉴定关键模块
对DEGs进行WGCNA分析，软阈值设置为5，共鉴定到8个模块，其中蓝色模块与总生存期显著正相关（图3）。
图3 WGCNA分析
6.蓝色模块基因的生存分析
对蓝色模块中的基因进行KM分析，有57个基因与总生存期显著相关。
7.可视化基因表达模式和功能富集分析
对这57个基因选择上调程度最高的5个基因，COL10A1,MUC16,CXCL5,GREM1和EPYC，这5个基因与总生存期显著负相关。下调程度最高的基因FOXA2, DNASE1L2, EPHA10和WFIKKN1与总生存期显著正相关。GO和KEGG富集分析结果如图4所示。
图4预后相关基因的GO和KEGG分析
8.构建PPI网络和鉴定预后相关基因
对这57个预后相关基因构建PPI网络（图5A）。使用MCODE插件构建PPI网络中关键的子网络（图5B和5C）。该网络中包括16个核心基因，分别为MMP14, LOX, SERPINE1, DKK1,WNT2,TWST1,FOXA2,WNT7A,COL6A1,COL10A1,COL6A3,COL12A1,SNA1I2,FGF2,MMP11和PLAU。
图5构建PPI网络鉴定关键子网络
9. GEO数据集验证
作者使用额外数据集验证这57个基因的预后价值（图6）。其中有19个基因与PAAD生存期显著相关。
图6 GEO数据集验证基因的预后价值
10.预后基因表达水平与肿瘤纯度和免疫浸润的相关性
根据PPI网络和GEO数据集验证作者鉴定到4个预后相关基因。作者使用TIMER研究这4个基因表达水平与肿瘤纯度和免疫细胞浸润的相关性。COL6A3,PLAU,MMP11和MMP14与肿瘤纯度相关性较弱，而与CD8+ T细胞，CD4+ T细胞，B细胞，树突状细胞和中性粒细胞正相关。如图7所示，COL6A3,PLAU,MMP11和MMP14表达水平与M0巨噬细胞浸润水平正相关，PLAU表达水平与T细胞，CD4记忆静息细胞浸润水平负相关。
图7核心基因与22种免疫细胞类型的相关性
11.临床实验验证
已有研究结果表明MMP11和MMP14在胰腺癌组织中过表达。因此，作者使用IHC验证中国胰腺癌患者中PLAU的表达水平。IHC结果表明胰腺癌组织中PLAU蛋白水平较高（图8）。此外，PLAU蛋白水平与淋巴结转移和TNM分析显著相关（表1）。
图8 IHC结果
表1 PLAU表达水平与临床病理特征的相关性
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结论
本研究作者对TCGA-PAAD数据集进行了全面的生物信息学分析并鉴定到4个具有预后价值的基因。其中，PLAU与TNM分期和淋巴结转移显著相关。作者的研究表明PLAU可以作为一个预测PAAD患者预后和生物标志物并为PAAD治疗提供了新的靶点。然而，还需要更多的实验验证PLAU的价值。
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