本文由医信融合团队成员“张皓旻”撰写，已同步至微信公众号“医信融合创新沙龙”与“表观精准治疗”，更多精彩内容欢迎关注！
获得转录组数据（.fastq 文件）后的第一步就是对原始数据的质量评估。
目的
质量评估的目的是全面查看原始数据的质量，内容包括碱基质量评估、GC 含量检验、N 碱基数量评估、TCGA 碱基分布、k-mer 数量检验等。
方法
检验 fastq 文件质量的软件有很多，例如 FastQC、fastp、multiQC 等。本文主要介绍应用最多的 FastQC。
FastQC 是一款基于 Java 的软件，须在 linux 环境下使用命令行运行，它可以快速多线程地对测序数据进行质量评估（Quality Control），其官网地址为：Babraham Bioinformatics。
安装
FastQC 可以使用 conda 进行安装。在 linux 环境下运行命令conda install -c bioconda fastqc=0.11.9即可，运行结果如下图。
运行命令fastqc -h可检验其是否成功安装，运行结果如下图。
运行
#运行命令的基本格式
# fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN
#主要是包括前面的各种选项和最后面的可以加入N个文件
# -o --outdir FastQC生成的报告文件的储存路径，生成的报告的文件名是根据输入来定的
# --extract生成的报告默认会打包成1个压缩文件，使用这个参数是让程序不打包
# -t --threads选择程序运行的线程数，每个线程会占用250MB内存，越多越快咯
# -c --contaminants污染物选项，输入的是一个文件，格式是Name [Tab] Sequence，里面是可能的污染序列，如果有这个选项，FastQC会在计算时候评估污染的情况，并在统计的时候进行分析，一般用不到
# -a --adapters也是输入一个文件，文件的格式Name [Tab] Sequence，储存的是测序的adpater序列信息，如果不输入，目前版本的FastQC就按照通用引物来评估序列时候有adapter的残留
# -q --quiet安静运行模式，一般不选这个选项的时候，程序会实时报告运行的状况。
使用fastqc -o #输出结果全路径#数据存储全路径/*reads_R1.fq命令运行
对我们在RNA-Seq 数据分析准备—SRA 数据下载及整理中下载并整理好的数据（GSE176393）进行质量评估
运行后可获得如下结果。
结果解读
看懂质量评估的结果是非常重要的！！！
Basic Statistics基本信息
报告第一部分是对质量检测结果的基本信息统计，如上图所示。其中包括：
• Filename：检测的 fastq 文件名称；
• File type：文件类型；
• Encoding：测序平台的版本和相应的编码版本号；
• Total Sequence：总 reads 数；
• Sequences flagged as poor quality：低质量序列数量；
• Sequence：测得的序列长度范围；
• %GC：GC 含量。
Per base sequence quality序列测序质量统计
上图显示了检测 fastq 文件的整体碱基质量分数统计。
• 横轴表示测序文件中所有序列第一个碱基到最后一个碱基，纵轴表示质量得分；
• 红线表示中位数，蓝线代表平均值；
• 柱状表示该位置所有序列的测序质量的统计，柱状（黄色）是 25%~75% 区间质量分布，error bar（触须）是 10%~90% 区间质量分布；
• 一般要求所有位置的 10% 小于 20，即最多允许该位置 10% 的序列低于 Q20，即 90% 的序列的碱基质量都大于 Q20，即 90% 的序列碱基错误率不超过 99%。当任何碱基质量低于 10，或者任何中位数低于 25 时报 WARN；当任何碱基质量低于 5 或者任何中位数低于 20 报 FAIL。
Per tile sequence quality每个tail测序的情况
上图展示了每个 tail 的测序情况。
• 横轴表示每个碱基的位置；
• 纵轴是 tail 的 Index 编号；
• 这个图主要是为了防止，在测序过程中，某些 tail 受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低；
• 蓝色代表测序质量很高，暖色代表测序质量不高，如果某些 tail 出现暖色，可以在后续分析中把该 tail 测序的结果全部都去除。
Per sequence quality scores每条序列的测序质量统计
对每条序列（reads）的测序质量统计。
• 假如我测的 1 条序列长度为 101bp，那么这 101 个位置每个位置 Q 值的平均值就是这条 reads 的质量值；
• 该图横轴是 0-40，表示 Q 值，即该序列（reads）质量得分；
• 纵轴是每个值对应的 reads 数目；
• 我们的数据中，测序结果主要集中在高分中，证明测序质量良好。
Per base sequence content序列各个位置碱基比例分布
上图显示了 A T C G 在每个位置的平均分布情况。
• 横轴表示每个碱基的位置，纵轴表示百分比；
• 图中四条线代表 A T C G 在每个位置平均含量；
• 理论上来说，A 和 T 应该相等，G 和 C 应该相等，但是一般测序的时候，刚开始测序仪状态不稳定，很可能出现上图的情况。像这种情况，即使测序的得分很高，也需要 cut 开始部分的序列信息。
Per sequence GC content序列平均GC分布
上图展示了序列平均 GC 分布。
• 横轴为平均 GC 含量；纵轴为每个 GC 含量对应的序列数量；
• 蓝线为系统计算得到的理论分布；红线为测量值，二者越接近越好；
• 这里不相符可能有两个原因：
1. GC 可以作为物种特异性根据，如果出现了其他的峰则提示有可能混入了其他物种的 DNA；
2. 目前二代测序基本都会有序列偏向性 (所说的 bias)，也就是某些特定区域会被反复测序，以至于高于正常水平，变相说明测序过程不够随机。这种现象会对以后的变异检测以及 CNV 分析造成影响。
Per base N content N碱基含量分布
上图 N 碱基含量分布
• N 碱基是指仪器不能识别的碱基，一般不会出现。但是如果出现并且量还很大，应该就是测序系统或者试剂的问题；
• 任意位置的 N 的比例超过 5%，报 "WARN"；任意位置的 N 的比例超过 20%，报 "FAIL"。
Sequence Length Distribution序列测序长度统计
上图展示了检验文件中序列的长度统计。
• 每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的，但是总会有一些偏差；
• 比如此图中，126-127bp 是主要的，但是还是有少量的 120-121bp 的长度，不过数量比较少，不影响后续分析；
• 当测序的长度不同时，如果很严重，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信。
Sequence Duplication Levels统计序列完全一样的reads的频率
• 谈到 NGS 数据的 duplicated reads（暂且翻译为 “重复数据”），我们通常会直观地认为：duplicated reads 是在 NGS 文库构建过程中，由于 PCR 过度扩增导致同一个模板 DNA 片段被反复测序多次，得到一模一样的 reads；
• 上图中横坐标是 duplication 的次数；纵坐标是 duplicated reads 的数目（红线）；
• 正常情况下的确，测序深度越高，越容易产生一定程度的 duplication。高程度的 duplication level，提示我们可能有 bias 的存在（如建库过程中的 PCR duplication）。
Overrepresented sequences大量重复序列
• Overrepresented sequences 是指一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如 1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。这个模块列出来大于全部转录组 1% 的 reads 序列，但是因为用的是前 200,000 条，所以其实参考意义不大，完全可以忽略。
• 和 duplication 计算一样，取前 200,000 进行统计，大于 75bp 只取 50bp；
• 发现超过总 reads 数 0.1% 的 reads 时报”WARN“，当发现超过总 reads 数 1% 的 reads 时报”FAIL“；
Adapter Content序列Adapter
• 此图衡量的是序列中两端 adapter 的情况
• 如果在当时 fastqc 分析的时候 - a 选项没有内容，则默认使用图例中的四种通用 adapter 序列进行统计
• 本例中 adapter 都已经去除，如果有 adapter 序列没有去除干净的情况，在后续分析的时候需要先使用质控软件进行去接头。
接下来就是基于 QC 结果对数据进行质量控制，cutadapt、Trimmomatic、fastp 等许多软件都可以完成这一工作，随后会一一介绍。
关于测序数据的质量评估先介绍这么多，需要交流学习经验可以留言或添加下方小编微信，一起学习吧！！
小编微信号 : BioinforTec
图文：张皓旻
本文编辑：李晨龙
