摘要：正常免疫的角膜中的炎症可引发病理性血管生成反应，导致威胁视力的角膜新生血管。然而，炎症通路是众多的、复杂的并且以时间依赖的方式被激活。有效解决角膜中的炎症和相关血管生成需要了解这些途径及其时间依赖性，迄今为止，这些途径在很大程度上尚未被探索。使用内源性炎症模型诱导的角膜新生血管模型，我们研究了炎症基因在影响毛细血管退行和角膜透明度恢复中的时间依赖性。大鼠角膜内源性毛细血管退行性变的特点是血管新生毛细血管逐渐变薄和重塑，炎症细胞在体内消退。通过全基因组纵向微阵列分析，通过全基因组纵向微阵列分析，VEGF配体受体信号转导和炎症通路的早期抑制先于LXR/RXR、PPARα/RXRα和STAT3信号通路，同时减弱LPS/IL-1对RXR功能和Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。潜在的下游炎性细胞因子如Cxcl5、IL-1β、IL-6和Ccl2在重塑阶段同时下调。炎症通路上游调节因子包括SOCS3、SPARC和ApoE。促炎与抗炎信号通路之间复杂且协调的时间依赖性相互作用突出了LXR/RXR、PPARα/RXRα和STAT3信号通路在解决炎性角膜血管生成中的潜在抗炎作用。
关键词：角膜新生血管 炎症 新生血管形成 重塑
简介：在炎症反应早期，局部损伤诱导细胞凋亡和细胞因子信号传导，促进白细胞从周围角膜缘和结膜区域的毛细血管和组织迁移到受影响部位的角膜。炎性细胞促进进一步的细胞因子产生，建立细胞因子浓度梯度，导致随后的缘毛细血管扩张和新生血管萌发。解决炎症对于管理角膜新生血管是至关重要的；然而，各种激活的炎症途径及其时间重要性仍不清楚。角膜炎症可随时间自然消退，据报道，毛细血管回归与M2表型巨噬细胞的聚集有关。如NF-κB、PI3 K和cAMP等途径参与炎症的凋亡消退，但这仅表现在确定的细胞类型中。鉴定与病理性角膜炎症和血管生成有关的许多重要炎性细胞因子和因素，这些因素是以协调的方式作用的。临床上类固醇被广泛用于抑制炎症；然而，这些药物同时和不加区分地靶向许多炎症和生理通路，导致包括青光眼和白内障在内的副作用的风险。因此，深入研究参与炎症的关键炎症途径以及由此产生的血管生成反应可为针对特异性激活的炎症途径的改进治疗铺平道路。我们之前已经证实抑制炎症和血管生成基因是早期消退期毛细血管重构的特征。在这项研究中，我们假设不只是炎症通路抑制的启动对于血管回归是重要的。炎症通路的持续抑制以及其它血管重构通路的同时激活表征了随时间的衰退和重塑过程。
结果：分层聚类分析揭示炎症性血管生成和毛细血管重塑的时间依赖性差异：采用缝线诱导的大鼠角膜炎症血管生成模型，研究炎症介导的角膜新生血管丛随时间的变化。两个尼龙缝合线置于基质内诱导早期炎症反应，随后从边缘处预先存在的毛细血管向缝合线方向萌发。当新的毛细血管芽到达缝合线的一半（指定为时间点0h）时，将各组大鼠分为重塑臂和萌芽臂。在重塑臂中，在0小时取出缝线以诱导随后的毛细血管回归，而在萌芽臂中保留缝合线以提供炎性血管生成的持续刺激。根据用于监测新生血管反应的数字图像，在24-120小时期间，重塑臂相对于萌芽臂可见水肿和炎症被抑制。IVCM检查显示，浸润性炎症细胞在萌芽臂角膜基质中持续存在，而在重塑臂角膜基质中不存在。此外，巨噬细胞是重塑臂中72和120小时的主要炎性细胞类型。使用体内共聚焦显微镜来监测角膜中的毛细血管灌注和细胞浸润，观察到萌芽臂和重塑臂中的毛细血管随时间收缩。然而，在24和72小时，重塑臂的收缩更大。对单个大鼠的整个转录组微阵列数据的分层聚类分析显示在给定时间点聚集。在萌芽臂中，重叠发生在0和24小时之间，然而，一个独特的聚类模式，从24到120小时。在重塑臂中，样本根据时间点单独聚类。在发芽臂和重塑臂中观察到的聚集模式表明强烈的时间依赖性转录反应。
差异通路分析揭示时间依赖性炎症通路抑制和重塑途径激活：初步筛选了DEG和QIAGEN知识库之间显著重叠的富集路径，其中p值<0.05被认为是显著的，并且进一步分析了满足该标准的路径。跨臂的时间依赖性通路分析表明在重塑臂中有两个通路富集的阶段。在第一阶段，在24h早期，一些关键的炎症和血管生成途径被抑制，包括ILK信号、IL-6信号、内皮素-1信号、VEGF家族受体配体信号、Jak/stat和ERK5信号。在第二个阶段72h末期，LXR/RXR和STAT3通路在重塑臂中被激活，同时抑制了LPS/IL-1通路对RXR功能的影响。LXR/RXR途径在萌芽臂的同一时间点受到相反抑制。这三条通路的激活/抑制模式在重塑臂中持续120小时。此外，在萌芽臂中72小时激活的许多炎症通路在重塑臂中不再活跃。此外，PPARα/RXRα激活途径在萌芽(抑制)臂和重塑(激活)臂之间有差别的调节。分析还揭示了其他可能感兴趣的炎症和重塑途径，如IL-8信号、大肠癌转移和Wnt/β-连环素信号。在重塑臂中，激活途径LXR/RXR激活和STAT3以及抑制途径Wntβ连环素信号转导和LPS/IL-1抑制RXR功能，在72～120h呈现持续激活/抑制状态。着眼于重塑臂，我们接下来识别和评估这些途径中涉及的基因的时间依赖性。
重塑臂内富集途径中的基因具有时间依赖性表达模式：如上所述，在重塑臂中72和120小时之间比较在晚期重塑阶段富集的典型通路中的DEG。在激活途径LXR/RXR激活和STAT3中的许多基因，以及抑制通路Wntβcatenin信号和LPS/IL-1抑制RXR功能的基因，在两个时间点都是共同的。此外，评估了富含重塑臂途径选择的基因相对于0h(缝线移除时间)从24到120h的时间变化，所有被检测的基因在萌芽和重塑臂之间均具有p值<0.05。在LXR/RXR信号通路中，促炎性细胞因子如S100钙结合蛋白A8（S100A8）和基质金属蛋白酶-9（MMP9）随着时间的推移逐渐抑制，而Vegfa和Vegfc在ILK和VEGF配体受体信号通路中逐渐被抑制。
LXRS在不同细胞群体的角膜中表达：本文用角膜组织切片免疫荧光法和角膜裂解物免疫印迹法检测LXRα和LXRβ蛋白在角膜中的表达。在自然角膜中，LXRα和LXRβ在上皮表层和基底细胞以及基质细胞中均有表达。在缝合的角膜中，这些受体的表达与浸润的炎性细胞有关，而上皮的表达在萌芽期间减少。相反，在重塑过程中，由于存在较少的炎性细胞，整体基质表达减少，而上皮表达被重新建立。强调重塑臂72h的时间点，CD45 +、CD68 +和CD163+细胞共表达LXRα和LXRβ。CD45+白细胞亚群表达LXRα和LXRβ，包括CD68+单核细胞/巨噬细胞和CD163+重塑巨噬细胞。
LXR下游的基因和原型炎症基因在角膜组织重塑和萌芽过程中受到不同程度的调控：LXR活性的下游靶点：ATP结合盒转运体a1（Abca1）和载脂蛋白E（ApoE）分别在角膜横切面上与CD68+和CD163+细胞相关联。基因芯片观察ABCA1和ApoE的表达趋势。研究LXR和PPAR激活对促炎基因具有抑制作用。我们和其他人先前已经证实在炎症性角膜血管生成中细胞因子的表达上调。通过qPCR，观察到C-X-C基序趋化因子配体5(Cxcl5)、趋化因子(C-C基序)配体2(Ccl2)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)在72h时点与发芽臂相比在毛细血管重塑中均受到抑制，从微阵列数据中确定基因表达的趋势。
重塑反应的上游调控分析：上游调控分析是建立在给定上游调节器的编码蛋白活性的预测上，而不是围绕分子的基因表达谱的预测。该分析有助于识别识别驱动分子在实验数据中观察到的基因表达谱。我们分析了具有偏向于观察到的LXR/RXR优先激活和PPAR信号转导途径的上游调控因子在重塑中的作用。24h的上游调节分析显示细胞因子信号转导抑制因子3(Socs3)作为唯一激活的上游调节因子(激活z评分2)，其中MYC原癌基因、bHLH转录因子(Myc)和IL-1β是最受抑制的调节分子(抑制z评分分别-2和分别为-4.5）。分析显示Socs3激活Abca1，它是LXR调节炎症反应的中心分子之一。72h时，Myc和IL-1β进一步受到抑制（抑制z评分分别为-4.2和-4.1），而分泌酸性蛋白和富含半胱氨酸的基因（Sparc）被激活（激活z评分2）。发现SPARC激活胶原COL1A1和COL1A2等。120h时，Myc和IL-1β受到抑制，72h时明显升高，而ApoE和Sparc则被激活（激活z值分别为2和2.5）。我们发现ApoE可以调节许多基因，但最重要的是，可以激活参与LXR活性的Abca1和Abca2。
结论：在本研究中，我们发现角膜炎症的解决是一个时间依赖的过程，其特点是炎性细胞从基质中消失，新生血管变薄，促血管生成和促炎途径的强烈下调以及促炎症通路和炎症基因如CXCL5、IL-1β、IL-6和CCL2的抑制。在VEGF信号转导和其他血管生成和炎症通路的初始抑制后，LXR/RXR、PPARα/RXRα和STAT3通路的进行性激活，可能是本研究所观察到的炎症消退和毛细血管重构的原因。 这些途径及其相互作用的研究值得密切关注。SOCS3、SPARC和ApoE等因素可能是这些过程的上游调控因素，也值得进一步研究。
