丝状噬菌体是一类常见的细菌病毒，其长度约为1-2 μm，直径约6-7 nm。丝状噬菌体的衣壳包裹着一个环状单链 DNA 基因组¹。病毒粒子的长度取决于其所包装基因组的大小和拷贝数²。丝状噬菌体的衣壳由数千个衣壳蛋白 pVIII 和仅有几个拷贝的四个次要衣壳蛋白(包括 pIII，pVI，pVII 和 pIX)组装而成³。与有尾烈性噬菌体不同，丝状噬菌体从宿主细胞释放通过一个类似于毒性因子分泌的过程，而不是通过裂解宿主细胞。尽管不同丝状噬菌体的结构已经被广泛研究，但是由于其奇特的外形，丝状噬菌体次要衣壳蛋白在病毒组装中的作用以及丝状噬菌体基因组包装的分子机制知之甚少。

2023年9月5日，清华大学医学院长聘副教授，北京生物结构前沿研究中心研究员，山西医科大学-清华大学前沿医学研究中心研究员向烨课题组在《自然-通讯》（Nature communications）杂志在线发表了题为"Cryo-EM structure of a bacteriophage M13 mini variant"（噬菌体 M13迷你变异体的冷冻电镜结构）的研究论文，报道了噬菌体M13一个迷你粒子的衣壳及内部ssDNA基因组结构，该研究提供了丝状噬菌体组装的全新分子机制。

基于1992年Specthrie, L等人的实验方法⁴，向烨团队对M13的基因组进行改造，并通过辅助噬菌体的帮助，成功表达出长度约为50 nm的迷你M13噬菌体，并对其进行冷冻电镜结构研究（图1）。在冷冻电镜数据分析中，应用block based reconstruction方法⁵，得到噬菌体的中间部分和两个末端的高分辨密度图，建立了完整衣壳的原子模型（图1）。通过对完整衣壳结构分析发现M13迷你噬菌体的末端由两个帽状复合物密封，这两个复合物由pVII，pIX，pIII和pVI这四种次衣壳蛋白组成。顶部帽复合物由 pVII 和 pIX 的五聚体组成，两者都具有单一的螺旋结构。顶部帽复合物内侧带电荷的残基，包括pVII 的Arg33和 pIX 的 Glu29，在空间上靠近内部基因组的包装信号区域。进一步通过突变研究发现这两个氨基酸残基在病毒组装中起着关键作用。M13迷你噬菌体中间部分与前人研究结果类似，是一个由pVIII组成的螺旋桶装结构。第一层pVIII的曲度相较于中间部分的分子更大，其在顶部帽状结构和中间螺旋部分中起到过渡作用。M13迷你噬菌体底部的帽状结构由具有钩状结构的pIII 和 pVI形成。PIII和pVI分子通过氢键和静电相互作用交替分布在pVIII螺旋桶末端外，并在底部收紧形成一个笔尖样结构。在对最后三层pVIII形成的pIII结合口袋分析表明pIII 在噬菌体衣壳组装末期可有效地与 pVIII 竞争，从而终止基因组的包装并帮助形成成熟的病毒粒子。

为了确定M13迷你噬菌体内部 ssDNA 基因组的结构，研究使用非对称重构方法对衣壳内部ssDNA进行结构分析，发现ssDNA具有右手双螺旋结构（图2A）。通过比较螺旋参数，M13迷你噬菌体内部 ssDNA 基因组的螺旋结构与A型dsDNA类似。这是研究者首次直接观测到丝状噬菌体环状ssDNA结构（图2）。进一步分析发现衣壳内表面带正电荷残基的非对称构象对于稳定内部ssDNA结构起到关键作用。

清华大学医学院长聘副教授，北京生物结构前沿研究中心研究员，山西医科大学-清华大学前沿医学研究中心研究员向烨为该论文的通讯作者，向烨课题组18级博士生贾麒为该论文的第一及唯一非通讯作者。清华医学院已毕业的黄亮博士在冷冻电镜数据收集方面为本研究提供了帮助。清华大学药学院张数一教授和武汉大学殷雷教授为本研究提供了实验材料。中国科学院生物物理所章新政研究员对非对称重构提供了支持。清华大学中国蛋白质科学中心（北京分中心）提供了设施支持。该项目研究获得山西医科大学-清华大学前沿医学研究中心，中国科学技术部，清华大学万科公共卫生与健康学科发展专项基金，国家自然科学基金，清华大学春风计划基金，北京生物结构前沿研究中心和北京结构生物学高精尖中心的资助。

参考文献：

1. Rakonjac, J., Bennett, N. J., Spagnuolo, J., Gagic, D. & Russel, M. Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Curr Issues Mol Biol 13, 51-76 (2011).

2. Sattar, S. et al. Ff-nano, short functionalized nanorods derived from Ff (f1, fd, or M13) filamentous bacteriophage. Front Microbiol 6, 316 (2015). https://doi.org:10.3389/fmicb.2015.00316

3. Rasched, I. & Oberer, E. Ff coliphages: structural and functional relationships. Microbiol Rev 50, 401-427 (1986). https://doi.org:10.1128/mr.50.4.401-427.1986

4. Specthrie, L. et al. Construction of a microphage variant of filamentous bacteriophage. J Mol Biol 228, 720-724 (1992). https://doi.org:10.1016/0022-2836(92)90858-h

5. Zhu, D. et al. Pushing the resolution limit by correcting the Ewald sphere effect in single-particle Cryo-EM reconstructions. Nat Commun 9, 1552 (2018). https://doi.org:10.1038/s41467-018-04051-9