党参均一多糖CPA在Caco-2单层及小鼠体内的入胞机制及转运特点研究
党参为桔梗科植物党参 Codonopsis pilosula (Franch) Nannf、素花党参Codonopsis pilosula Nannf． var． modesta (Nannf) L.T.Shen 或川党参 Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，具有补中益气、健脾益肺的功效。临床主要用于脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消渴等症状。作为大宗药材，国内党参每年的消耗量约3.5吨。据2020版药典记载，约10%的中药方剂中含有党参，可谓“无参不成方”。依据党参的不同产区将党参分为台党（山西五台山），潞党（山西长治），东党（中国东北），条党（中国四川）。太行山位于华北平原和山西黄土高原之间，其特殊的地理位置和气候条件，为党参生长提供了得天独厚的生态优势，《本草从新》曾记载：“参须上党者佳”，太行山所产潞党参品质极佳，被认为是党参的道地产区。
潞党参为山西传统道地药材，多糖含量是反映潞党参道地品质的重要质量指标，而果聚糖是党参多糖的主要成分，也是党参的主要药理活性物质。课题组前期从党参多糖中分离出菊粉型果聚糖CPA，核磁和TOF-MS结构解析显示CPA分子量约为3.6 KDa，聚合度为31，动物实验结果显示党参多糖CPA对溃疡性结肠炎、胃溃疡等疾病有很好的干预作用，被认为是一种植物来源的有广阔应用前景的新药候选分子。但是，作为大分子多糖，CPA化学结构复杂，缺少光吸收和光发色基团，没有特定的紫外吸收光谱，常规的检测器难以对其检测分析，很难在生物样本中实现定量检测。课题组前期发现CPA在肠道组织中分布较少，CPA良好的治疗作用与其吸收入胞有关吗？CPA是否可以吸收入胞？是通过什么途径进入细胞的？等问题尚不清楚。
因此，为明确CPA能否入胞及其机制研究，山西医科大学药学院高建平教授团队，在Caco-2 细胞及小鼠体内进行了研究，首先选取临床常用荧光染料异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）作为荧光剂对CPA进行了标记，通过FTIR，UV以及HPGPC对产物进行了鉴定。利通激光总聚焦显微镜直观考察了CPA能否入胞，采用流式细胞仪考察了CPA的入胞特点，并进行了入胞机制的研究；最后在小鼠体内考察了CPA的药代动力学特征以及组织分布特点。本研究提供了CPA内化和转运的相关理论知识，为党参多糖的临床应用提供了理论依据。该研究成果于2022年8月31日在《International Journal of Biological Macromolecules》（IF=8.02）上以“Investigation of the internalization and transport mechanism of Codonopsis Radix polysaccharide both in mice and Caco-2 cells”为题在线发表。
该研究结果显示：
1. 本部分研究探讨了FCPA的入胞机制，分别用巨胞饮、小窝蛋白依赖性、网格蛋白依赖性、网格蛋白和小窝蛋白非依赖性抑制剂抑制相关蛋白，结果发现F-NH-CPA主要通过网格蛋白和小窝蛋白非依赖性途径进入细胞；使用溶酶体、微管蛋白抑制剂后，F-NH-CPA的胞内摄取量减少，表明溶酶体、微管蛋白参与了F-NH-CPA的胞内转运。
图1 FCPA的入胞特点
2.本部分研究模拟肠上皮细胞构建了Caco-2单层细胞模型，通过激光共聚焦显微镜直观考察CPA的胞内摄取，并通过流式细胞仪进行定量分析。研究结果发现细胞膜和细胞质中均有FCPA的荧光信号，表明FCPA可以被吸收进入细胞；进一步用流式细胞仪进行半定量研究，发现FCPA进入细胞具有时间、浓度依赖性。用Transwell小板构建的Caco-2单层细胞明确FCPA的摄取能力，结果表明FCPA吸收较差，只有较少的FCPA能进入细胞。
图2 FCPA的入胞机制
3. FCPA可以吸收入血，达峰时间较快，约为1 h，且在6 h出现了双峰。T1/2较短，为5.39 ± 1.73 h，CL/F为5.73 ± 3.09 L h-1 kg-1；平均滞留时间MRT为9.44 ± 2.73，其表观分布容积Vd/F为41.89 ± 12.42 L kg-1，药时曲线下面积AUC(0→∞)为11.36 ± 3.80 mg L-1 h-1，表明FCPA在小鼠体内分布广泛，滞留时间较长，消除较慢，不能迅速转移到外周组织或随尿液排出。FCPA可广泛分布到肝、肾、肺、胃、肠道等组织，组织浓度相当或者略高于同时间点血浆浓度，但整体浓度较低。
图3 FCPA的药代动力学及组织分布研究
药学院高建平教授为本文的通讯作者，药学院2019级博士研究生邵云云为本文的第一作者。该研究项目得到国家重大专项（2019YFC1710800 and 2019YFC1710801）的资助。
