实验动物中心王春芳课题组发现调控神经发育的关键microRNA分子
2021年6月11日，实验动物中心王春芳课题组在Experimental Biology and Medicine发表体味“miR-31 promotes neural stem cell proliferation and restores motor function after spinal cord injury injury”的研究论文，发现了在斑马鱼胚胎发育过程中，敲降miR-31的表达后，斑马鱼的侧索神经元不发育，并伴有大量的凋亡颗粒，丧失运动功能。
脊髓损伤后的神经再生及突触连接一直是治疗脊髓损伤的难点。现有研究证实在脊髓损伤后局部注射神经干细胞可以有效恢复损伤后的运动和感觉功能1。但神经干细胞的获得和使用收到伦理学的限制。而在课题组前期的研究中发现，miR-31在神经干细胞高表达在运动神经元低表达2。对miR-31进行生物信息学分析的研究也显示，miR-31在物种间高度保守，由此推测miR-31可能在NSCs的分化过程中起着重要重要作用。同时，Liu等也发现，在SCI后，miR-31表达增高3，说明miR-31在SCI的修复过程中起着一定作用。Xu的实验说明脊髓结扎后的3天、7天和13天血清中miR-31的表达升高4，HL Chang证实在SNL、DRT和VRT损伤7天后DGR神经元的miR-31的表达上调5。但miR-31具体的治疗机制及在神经发育中的具体作用未知。
为了研究miR-31调控神经发育的具体作用和相关机制，王春芳课题组先通过生物信息学分析，预测miR-31是否会对神经发育产生作用。证实后，在HB9:EGFP转基因斑马鱼的基础上，构建了斑马鱼的miR-31敲降模型。结果发现miR-31敲降后斑马鱼的脊索及侧索发育异常，MNs数量减少，斑马鱼丧失运动功能。同时，AO染色显示在miR-31 MO斑马鱼的中枢神经部位和尾部出现大量凋亡细胞，但在侧索部位未出现凋亡颗粒。
图1-1 Morpholino敲降miR-31表达后导致斑马鱼MNs发育异常。
斑马鱼胚胎注射了8ng miR-31 MO或8ng Standard Control后MNs的生长发育状况（A-H）。荧光显微镜下可以观察到48 hpf时的斑马鱼躯干部位的MNs（白色箭头）的及其结构，在Standard Control组可以发现脊索和侧索正常发育（B-D）。而在miR-31 MO组，发现脊索荧光强度较Standard Control组低，侧索无法观察到，神经系统发育异常（F-H）。同时逃逸反应显示48 hpf的miR-31 MO组斑马鱼无反应。
图2软件分析对比miR-31MO组和Standard Control组斑马鱼脊髓部位出现凋亡颗粒的情况。
为了验证MNs缺失是否由凋亡引起，我们使用AO评估斑马鱼在26 hpf时的细胞凋亡情况。对照组与miR-31 MO组比较发现，对照组中仅有少量凋亡颗粒，而miR-31 MO组则有大量凋亡颗粒沿中枢神经系统脊索呈线性分布。此外，侧区凋亡颗粒相对较脊索部小。Image J定量分析了miR-31 MO与对照组的凋亡颗粒数量，发现miR-31 MO的平均凋亡颗粒数量为125.9个，而对照组为5个，差异为25倍。这些结果表明，miR-31敲降后，斑马鱼的脊髓部位在神经元缺失的情况下，同时出现大量细胞凋亡，侧索未形成，斑马鱼失去运动功能。
NSCs对神经系统的注射治疗正越来越受到人们的关注，但是如何获取NSCs是困扰人们的难题。综合以上实验，我们推测miR-31可以促进内源性NSCs的存活和增殖。对于需要注射NSCs进行治疗的SCI患者或其他中枢神经受损的病人，可以在体外合成miR-31 agomir，注射至体内，促进内源性NSCs的增殖和分化，用于治疗神经损伤类疾病，避免诸多麻烦。
1. Piltti KM, Funes GM, Avakian SN, et al. Increasing Human Neural Stem Cell Transplantation Dose Alters Oligodendroglial and Neuronal Differentiation after Spinal Cord Injury. Stem Cell Reports 2017;8:1534-48.
2. Wei H, Wang C, Zhang C, Li P, Wang F, Zhang Z. Comparative profiling of microRNA expression between neural stem cells and motor neurons in embryonic spinal cord in rat. Int J Dev Neurosci 2010;28:545-51.
3. Liu NK, Wang XF, Lu QB, Xu XM. Altered microRNA expression following traumatic spinal cord injury. Exp Neurol 2009;219:424-9.
4. Xu Y, Zhang X, Pu S, Wu J, Lv Y, Du D. Circulating microRNA expression profile: a novel potential predictor for chronic nervous lesions.生物化学与生物物理学报(英文) 2014;46:942.
5. Chang HL, Wang HC, Chunag YT, et al. miRNA Expression Change in Dorsal Root Ganglia After Peripheral Nerve Injury. Journal of Molecular Neuroscience 2017;61:169-77.
