山西医科大学二院张永红团队揭示骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335促进骨折恢复作用机制研究

目前，骨组织修复及自愈的机制尚未得到完全的揭示，越来越多的研究转向有促进组织修复及再生能力的干细胞来源的囊泡中，其中囊泡中miRNA作为一种良好的生物标志物在疾病进展及疾病治疗中发挥了巨大的作用，也引起了极大的关注，但是并没有太多的基础研究聚焦在外泌体促进骨折恢复的机制研究上

2021年2月4号山西医科大学二院张永红团队在杂志《Cell Death and Disease》上正式发表题目为“Role of microRNA-335 carried by bone marrow mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles in bone fracture recovery”的研究论文，阐述了骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过VapB和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制。

第一部分：构建小鼠骨折模型、培养骨髓间充干细胞（BMMSCs）分离及鉴定胞外囊泡（EVs）。1.研究使用C57BL/6小鼠以及实验室改造完成并正常繁育饲养的C57BL/6 CD9-/-遗传型小鼠进行构建骨折模型；所用细胞为小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）。2. 从培养4-6代的BMMSCs中提取B-EVs，通过透射电镜、Western Blot以及纳米粒径分析仪鉴定E-BVs的形态、特异性蛋白（CD11b、CD 45、CD29以及CD90）的表达情况以及粒径大小；3. 野生型（wild type，WT)和CD9-/- C57BL/6小鼠中使用C形工具施加三点弯曲产生横向股骨干骨折，在建模结束后的0、1、2、3、4周，对小鼠骨折模型骨愈合情况进行分析，通过高分辨SKYSCAN进行活体显微影像学分析、计算机断层扫描骨密度等进行分析，验证小鼠骨折模型。

BM-MSCs细胞中提取EVs，通过纳米粒径分析、透射电镜分析及Western Blot分析结果证明分离得到的B-EVs的正确性，可以用于后续研究；两组小鼠在建模前即可检测时，野生型小鼠的体重和骨密度无显著差异，CD9-/-小鼠胫骨生长板的宽度显著减少，野生型小鼠在骨折后2周通过骨痂形成表现出软骨内骨化， 3周时骨愈合明显，与野生型小鼠相比，CD9-/-小鼠表现出骨折愈合的显著延迟。骨折后3周CD9-/-小鼠骨愈合率为25%，明显低于野生型小鼠，表明与野生型小鼠相比，CD9-/-小鼠的愈合能力下降；

A：EVs分离纯化的步骤；B：透射电镜检测EV的形态；C：NTA检测EVs的大小及分布情况；E：western blot检测EVs的特异性蛋白

两组小鼠CD9-/-小鼠骨折愈合受损情况分析

（A） X射线检测骨愈合率；（B）骨愈合率检测两组小鼠的骨愈合情况；

（C）骨折后2周和3周切取WT和CD9-/-小鼠股骨，用H&E染色；比例尺= 100 μm

第二部分：EVs干预下骨折小鼠模型中差异miRNA的鉴定。1.分组：对构建的小鼠模型进行分组，分别为WT + NC组（GW4869干预后，EV-NC注射的WT小鼠）、WT + EVs组（注射B-EVs的WT小鼠）、WT + EVs-Mock组（注射B-EVs的WT小鼠预先转染miR-335抑制剂NC）、WT + EVs-Inhibitor组（WT小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor）；CD9-/-小鼠分别分为：CD9-/-+ NC组（CD9-/-小鼠注射GW4869干预后的EV-NC）、CD9-/-+ B-EVs组（CD9-/-小鼠注射B-EVs）、CD9-/-+ EVs-Mock组（CD9-/-小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor NC）、CD9-/-+ EVs-Inhibitor组（CD9-/-小鼠注射B-EVs前转染miR-335抑制剂）。2.EVs的注射时间及剂量：各组小鼠均于骨折后第1天和第8天在骨折部位注射EVs 100 μL或外泌体抑制剂GW4869作用下的EV-NC 100 μL；3.使用pCDH质粒通过慢病毒转染建立过表达miR-335-inhibtor和 EVs-Inhibitor的稳定骨细胞系；4. 骨折建模后2周切取WT小鼠和CD9-/-小鼠股骨，将组织在4%缓冲多聚甲醛中固定48 h，随后用缓冲EDTA进行脱钙处理。5. 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2)；6. RT-qPCR检测差异表达miRNA的表达水平；7. 放射免疫沉淀试验分析提取总蛋白；8. 微阵列检测差异表达3只WT + PBS治疗的小鼠和3只WT + B-EV治疗的小鼠miRNA；9. 通过SPSS21.0进行统计分析。

本部分实验显示：B-EV处理促进了成骨细胞的分化和骨折的恢复；EVs对CD9-/-小鼠的治疗作用明显低于WT小鼠； 与WT小鼠相比，EV处理后的CD9-/-小鼠软骨组织中73个miRNA下调，104个miRNA上调，挑选差异表达最显著的miR-335、miR-136、miR-125a、miR-217、miR-487a、miR-339、miR-298和miR-133a进行后续实验； EvimiRNA在线预测网站上分析miR-335的分布，结果发现，miR-335在骨髓间充质干细胞中含量丰富，我们推测miR-335可能在骨折的修复中发挥作用。外泌体抑制剂GW4869对B-EVs的分泌无明显影响；5. HE染色、甲苯胺蓝染色及BMP2免疫组化结果显示B-EV中miR-335对小鼠骨折恢复具有促进作用；

放射学及HE染色检测EV治疗后第0周、1周、2周、4周骨折小鼠的恢复情况

（A,B）骨折小鼠的X射线检测结果，骨愈合评分；（C）骨折建模后2周，切除小鼠股骨，进行HE和苯胺蓝染色以及免疫组化BMP2检测。

从转染miR-335抑制剂或其阴性对照Mock的培养了48 h BMSCs中提取EVs,并在骨折后第1天和第8天对WT和CD9-/-骨折小鼠进行处理；

（A）EV治疗后0、1、2和4周WT和CD9-/-骨折小鼠的代表性放射学图像。（B）HE染色、甲苯胺蓝染色、BMP2的免疫化学观察EVs抑制剂治疗WT和CD9-/-骨折小鼠股骨骨折愈合情况。（C）RT-qPCR和（D）western blot分析测定骨折后2周小鼠股骨α-SMA、OCN、GDF-10、FGF-2的mRNA和蛋白水平。

第三部分：microRNA-335通过囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）和典型Wnt/β-catenin通路（Canonical Wnt/β-catenin pathway，Wnt/β-catenin）促进骨折恢复。1.通过MTT检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63的活力、Tunel及Alizarin red检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63细胞凋亡。2. 碱性磷酸酶染色检测培养的小鼠骨细胞，使用AP染色液进行染色，使用光学显微镜对红染细胞集落与无色集落进行计数，荧光显微镜下观察细胞；3. 依据Lipofectamine 2000的说明书，将质粒分别与mimic NC或mimic miR-335共转染HEK293T细胞。使用Dual-Glo®双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-335和VapB之间的结合关系；4. RNA pull down检测蛋白作用关系，使用识别RBP的一抗来检测目标RBP与适当的第二抗体一起孵育以识别第一抗体，并使用增强型化学发光检测信号；

本部分研究结果：1. MTT方法检测了成骨细胞MC3T3和MG63细胞的增殖率，结果发现EVs的处理促进了细胞增殖。TUNEL染色结果显示，EV处理可抑制细胞凋亡；2. F-actin的免疫荧光染色观察了MC3T3和MG63细胞的细胞粘附，发现B-EV处理对细胞粘附无明显影响；3. 人I型胶原蛋白（Human type I collagen，ColⅠ）的免疫荧光染色证明B-EVs促进ColⅠ表达，与茜素红染色结果一致。RT-qPCR和western blot分析验证B-EV处理可增加α-SMA、OCN、GDF-10和FGF-2的水平；4. RT-qPCR显示EVs-Inhibitor处理后miR-335表达明显下降，并伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加。而且，ALP、茜素红和ColⅠ免疫荧光染色发现，B-EVs携带的miR-335的干预部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用；5. 囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）能促进破骨细胞的生长，因此我们重点研究了VapB，HEK293T细胞中的双荧光素酶报告基因检测显示miR-335可以靶向VapB；6. RT-qPCR和western blot分析检测小鼠和细胞中VapB水平。结果显示，EV处理抑制了VapB水平，而miR-335抑制可以缓解VapB的抑制；7. miRwalk、TargetScan、EvimcrRNA和Starbase的网站上预测并筛选了miR-335的7个靶基因（SMARCA2、VAPB、NAA25、KLHL28、NUCKS1、RCC2和RBFOX2），通过文献调研，我们发现囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）能促进破骨细胞的生长。使用RT-PCR和western blot鉴定过表达VapB细胞的构建情况，RT-qPCR显示，转染后细胞中VapB mRNA的表达明显增加，使用western blot在蛋白中观测到了相似结果；MTT检测细胞活力及TUNEL染色检测细胞凋亡的结果表明，过表达VapB细胞的细胞伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加，表明VapB过表达诱导细胞凋亡；VapB过表达部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用。8. 过表达VapB可逆转EVs对Wnt和β-catenin蛋白表达的促进。提示EVs中靶向VapB的miR-335可能与Wnt和β-catenin通路有关。

从转染miR-335抑制剂或Mock的培养了48h的BMSCs中提取EVs，并作用于MC3T3和MG63细胞24h

（A,B）：MTT法测定MC3T3和MG63细胞活力。（C）TUNEL染色测定MC3T3和MG63细胞凋亡。（D）采用ALP法测定MC3T3和MG63细胞ALP活性。（E）茜素红染色验证MC3T3和MG63骨分化能力。（F）免疫荧光染色测定细胞ColⅠ的表达；（G、H）RT-qPCR和western blot检测测定α-SMA、OCN、GDF-10、FGF-2的mRNA和蛋白水平。

miR-355靶向作用VapB

（A）RNA pull-down实验验证MC3T3和MG63细胞中miR-335与VapB的结合。（B，C）通过RT-qPCR和western blot分析测定骨折小鼠模型或MC3T3和MG63细胞（D、E）中VapB mRNA和蛋白水平。

B-EVs携带的miR-335靶向VapB，通过激活Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复。（A，B）Western blot分析测定骨折小鼠股骨及MC3T3、MG63细胞Wnt/β-catenin相关蛋白水平。